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浅析梯度PCR PCR技术从发明至今已有二十多年的时间，用于PCR实验的仪器不断的推陈出新。然而PCR的基本过程没有太大变化，包括变性-退火-延伸这三步。当研究者进行PCR实验获得的结果不理想时，他们需要对PCR的组成要素进行优化。这其中包括反应条件、使用试剂的量甚至是引物等，在这里我们不一一介绍了。很多研究者在进行PCR优化时都会考虑退火温度的优化，这时就会进行梯度PCR。而为什么要通过梯度PCR来优化以及如何解决梯度PCR优化后所不能解决的问题，这些对很多研究者来说可能并不是很清楚，本文中将会对此作一浅析。 梯度PCR是针对每台PCR仪如何设置合适的退火温度进行摸索。它是以合成引物的退火温度为参考值，在进行同一个PCR反应时，同时设置多个退火温度进行PCR实验。这些退火温度呈现梯度递增或递减，通过梯度PCR最终确定适合仪器的退火温度。 虽然我们可以通过梯度PCR摸索出适合仪器的退火温度，但在实际应用中仍然会遇到诸多困难。例如我们在一台PCR仪上摸索出合适的退火温度，当换到另一台仪器（同一型号）上进行相同PCR实验时，有时获得的结果会不理想；在一台PCR仪摸索出的退火温度，换到其它品牌或型号的PCR仪上时，获得的结果也是不理想；使用一种耗材获得好的实验结果，当更换其它耗材时，同样获得不理想的结果等。遇到上述状况时，有时研究人员往往会很困惑，这是什么原因造成的？如何解决呢？ 我们不禁要问，难道我们设计和合成引物时推荐的退火温度不够准确吗？为什么还需要摸索适合仪器的退火温度呢？带着这些疑问，我们首先从PCR仪本身来了解一下出现上述问题的原因。我们知道在PCR仪上设置的温度是模块温度，但由于受到模块的材质及热传导效率、PCR反应管的厚度及与模块贴合的紧密性等因素的影响，模块的热能不能100%传递到反应管中，这就导致了模块温度与反应管中的温度的不一致性。例如银质模块会比铝制模块导热性能好；薄壁的PCR管比厚壁的导热性能高；另外，反应管与模块的贴合的紧密程度来看，贴合越紧密导热性能越好。图中显示出反应管与模块之间存在一定的间隙这种情况会导致一定的热量损失（图1）。所以出现上述状况的原因是由于模块温度与样品温度的不一致性造成的。 图1. 模块与反应管贴合示意图 那究竟模块温度与样品温度存在多大差异呢？我们对PCR反应时模块温度与样品内部温度进行实时监测，并绘制出标准PCR仪的温度曲线（图2）。从图中我们可以看出，变性温度（95）下降到退火温度这个过程时，模块温度与样品温度逐渐出现差异。当三种模块（Block55/53/57）分别下降到退火温度时，模块温度会进入平台期，此时样品温度与模块温度出现如下的差异：当模块温度进入平台期5秒钟时，样品与模块温度相差6.2；10秒钟时相差3.0；15秒时相差1.5。由于样品温度要达到模块温度会出现一定的延迟，所以为解决这种延迟我们往往需要进行梯度PCR实验，摸索出适合仪器的退火温度。 图2. T = Temp.-difference between block setting and real sample temp. 但即使我们通过梯度PCR摸索出适合仪器的退火温度后，在实际应用中仍需要再次进行梯度PCR。这主要是由于进行不同的PCR实验和使用不同仪器和/或耗材进行PCR实验时，模块温度与样品温度差异的不确定性所造成的。这样我们就能够了解进行梯度PCR的原因：不是由于获得退火温度理论值不准确，而是由于模块温度与样品温度的不一致性所造成。 众所周知，引物的退火温度可通过以下公式帮助您选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)，退火温度=Tm值-(5～10)。因此，对于每一个PCR实验都有一个理论的退火温度值。如果PCR仪能够保证较高的热传导效率，就可以保证模块温度与样品温度保持高度的一致性。这样我们就无需进行梯度PCR实验，只需使用退火温度的理论值即可获得理想的实验结果。如图3所示，可以看出这种PCR仪的模块温度和样品温度保持较好的一致性。当模块进入退火温度平台期5秒钟时，样品与模块温度仅差0.5；10秒时相差0.3；15秒时相差0.15。所以这台PCR仪设置的退火温度便可以如实地反映出样品温度。 图3. T = Temp.-difference between block setting and real sample temp. 综上所述，种种的问题主要是由于热传导效率的不同而导致样品温度和模块温度的差异以及这种差异的不确定性所造成的。梯度PCR摸索出的条件只有在PCR实验、仪器、试剂和耗材等绝对一致时才是有效的，否则任何一个组成要素的改变又会带来新的不确定性。显然要彻底解决以上问题，研究人员需要一款能够实现高效率的热能传导，并保持模块温度与样品温度高度一致的PCR仪来进行实