生物课件】分子生物学实验.ppt

实 验 内 溶 绪论—分子生物学实验的诞生和发展 分子生物学实验的基本知识简介 实验规范训练、实验准备 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化 PCR基因扩增及扩增产物的回收(核酸的回收) 琼脂糖凝胶电泳 质粒DNA的提取及其定性定量分析 核酸的定量 DNA重组－酶切连接、转化、筛选 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达及检测 免疫印迹 哺乳动物基因组DNA的提取及其定性定量分析 植物总RNA的提取及其定性定量分析 演示：Southern、DNA序列测定、RT－PCR及mRNA差异显示 设计实验及其实施 实 验 安 排 设计实验一: 原核生物的酶的克隆和原核表达 限定目标：目的基因－原核生物的酶、表达载体－pET21a 或 pETBlue－2 限制性内切酶：BamHⅠ和 HindⅢ 要求： 找到具体某一原核生物的某一编码基因的全序列利用分析件进行目的基因内部限制性内切酶的酶切分析及5’和3’末端引物的设计提交具体的实验方案（从提取全基因组到目的基因的重组、表达及活性分析） 第八个实验周前必须把详细的实验设计交给指导教师 第八个实验周指导教师组织全班同学讨论每个实验设计，确定两个最好的实验设计在全班进行具体的实验实践 设计实验二: 小麦看家基因的克隆 限定目标：小麦看家基因、表达载体－pET21a 或 pETBlue－2 限制性内切酶：BamHⅠ和 HindⅢ 材料：培养10天左右的小麦 要求： 找到小麦的具体某一看家基因（最好是酶）的基因 提交具体的实验方案（从材料准备到看家蛋白的克隆） 第八个实验周前必须把详细的实验设计交给指导教师 第八个实验周指导教师组织全班同学讨论每个实验设计，确定 一到两个最好的实验设计在全班进行具体的实验实践 基因工程又称DNA重组技术 外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内，使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的操作 包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程 有人也将其它使细胞基因组结构得到改造的体系也包括在基因工程内以区别于DNA重组 基因工程四要素：目的基因、工具酶、载体、受体细胞 工 具 酶 工 具 酶—限制性内切酶 特异地识别和结合于一段特殊的DNA序列（二元对称） 多数限制性内切酶识别长度为4-6个核苷酸，少数识别更长的核苷酸序列 切割双链DNA 切割后形成平端或粘端 BamHⅠ ↓ 5’NNGGATCCNN3’ 3’NNCCTAGGNN5’ ↑ DNA聚合酶 载 体 受 体 细 胞 受体细胞为外源基因的克隆和表达提供特定的环境和条件 载体体系一定要与受体细胞的基因型相配 如：利用α互补筛选的载体要选择ф80 lacZ△M15基因型的受体细胞才能实现α互补筛选 思考题 1. 受体细胞的特点什么？ 2. 都有哪些受体细胞？ 3. 载体和受体（宿主）细胞之间的关系是什么？ 4. 如何选择合适的受体细胞？ 目 的 基 因 的 来 源 和 分 离 基因组文库：基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体 cDNA文库：将真核细胞内全部mRNA转录成cDNA并将双链cDNA和载体连接，由此得到的cDNA克隆群体直接从特定的mRNA入手 PCR和RT-PCR 基因的化学合成 从蛋白质入手 思考题 1. 为什么需要目的基因？ 2. 如何鉴定目的基因？ 3. 如何获得目的基因？ 外 源 基 因 导 入 受体 细 胞 CaCl2处理后的细菌转化或转染 高压电穿孔 聚乙二醇介导的原生质体转化 原生质体融合 细胞核的显微注射 颗粒轰击技术 重 组 子 的 筛 选 1. 根据重组载体的特点进行筛选：抗药性筛选法、插入失活 2. 营养缺陷型筛选法：载体上携带某些营养成分基因而受体菌缺失 3. 限制性酶切分析 4. 核酸杂交：原位杂交、Southern、Northern 5. PCR 表达产物的检测：电泳、测活、蛋白印迹 序列测定 样品、试剂和材料等的保存 温度控制系统--冰箱：4 0C、-20 0C、-70 0C 恒温培养箱 细菌平板的培养 恒温空气摇床菌体的培养 灭菌器 PCR 仪 恒温水浴及微量加热器 电泳槽 电 泳 仪 凝胶成像系统电泳结果的定性和定量分析 台式高速冷冻离心机 样品的分离 分光光度计 超净工作台提供洁净工作环境 电子天平 pH 计精确的pH值测定 移 液 器液体试剂的精确取量 实验规范训练－仪器的操作 要求：仪器在未经培训前，不得擅自使用 严格按操作规程使用仪器， 有些仪器必须有教师在场时才能使用，并由教师操作 违