志贺氏菌检测技术课件.ppt

志贺氏菌检测技术 利川市疾病预防控制中心 王治元 志贺氏菌是引起人类细菌性痢疾的病原 菌，仅引起人类的肠道内感染，对其他动物 均无致病力，可随患者的粪便污染外环境。 细菌性痢疾至今仍然是我国城乡最为常 见的肠道传染病,病人和带菌者是本病的传染 源，尤以非典型病例、慢性患者和带菌者在 流行病学上的意义更为重要。 主要内容 生物学性状 标本采集和运送 分离培养 初步鉴定 血清凝集 系统生化鉴定 生物学性状 形态与染色 为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μ m ,宽0.5-0.7μ m 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。 培养特性 需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37℃，最适pH为6.4-7.8。37℃培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。 生化特性 能分解葡萄糖，产酸不产气（福氏6型和鲍氏13、14型的部分菌株会产生少量气体）。大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定，甲基红阳性，氧化酶、VP试验均阴性，不产生H2S和尿素酶。根据生化反应可进行初步分类。 常以甘露醇和乳糖发酵特性来区分志贺菌的生化群 志贺菌属抗原分类 标本采集 粪便标本 应尽量在抗生素应用前采集，采集新鲜粪便标本中的脓血、黏液部分1g～5g（水样便1ml～5ml）。 肛拭子或采便管 将标本立即保存于Cary-Blair运送培养基内送检 水标本 直接增菌法:直接采集可疑水样450ml，加入50ml 10倍浓缩的GN增菌肉汤，37℃增菌6～8h。 过滤集菌法：采集水样500～1000ml用无菌滤膜（ 0.45～0.65μm）过滤，取下菌膜直接贴种于选择性平板培养过夜或无菌条件下剪碎后放入9mlGN增菌肉汤，37℃增菌6～8h后转种平板 。 吸附沉淀法 食品 固体：于广口瓶或无菌塑料袋中，实验室无菌称取25g样品，剪碎后加入225ml GN增菌肉汤中， 37℃增菌6～8h。 液体：采取食品50～100ml，实验室无菌称（量）取25g（ml）样品加入225ml GN增菌肉汤中， 37℃增菌6～8h。 乳粉类应以无菌操作取25g放入装有225ml灭菌盐水的三角瓶中，摇匀，37℃增菌6～8h。 血液: 当怀疑为菌血症时，静脉采集5~10ml血液，按1:10比例加入血增菌培养液中进行培养。 其他标本: 疑似痢疾爆发疫情病原学检测时 外环境样本可采集患者的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、井水等，采集的标本应立即按1：10的比例接种GN增菌肉汤，置37℃增菌6～8h。 媒介昆虫如苍蝇类，用消毒蝇拍拍打10~15只/份,装入9mlGN增菌肉汤中，尽快送实验室，置37℃增菌4～6h。 标本运送 现场采集的粪便标本若在2小时内不能送达实验室，应置冷藏包中送检（内置冰排，可保存1~3天）。 水、食品等外环境标本若在2小时内不能送达实验室，应保存于带有冰排的采样箱内送检。 分离培养 直接分离 采用接种环多点蘸取粪便标本中可疑部分或用采样拭子直接涂种，接种于麦康凯（MAC）及海克顿（HE）肠道琼脂平板各一块。也可选XLD、SS、DHL或DCA，但应慎用SS琼脂，其可抑制Ⅰ型志贺菌生长。分离平板置37℃培养18~24h。 增菌分离 水、食品及其他标本于GN增菌肉汤中37℃增菌6~8h后，直接划线分离MAC及HE琼脂平板各一块，37℃培养18~24h。 在HE上为透明、白色或浅绿色菌落 。 在MAC上为无色（乳糖阴性） ，圆形，半透明，湿润、光滑、突起，大小为1～2mm的菌落。 初步生化反应 从37℃培养16～24h的分离培养基上，观察挑选可疑菌落，接种TSI或KAI培养基，先穿刺后划线，做好标记，取出后直接接种动力-靛基质-尿素（MIU）培养基，放37℃培养16h以上，观察结果。 志贺菌属在TSI上的生化反应为：斜面红色，底层产酸黄色，不产气。 在KAI上斜面红色，底层产酸黄色，不产气或有少量气体，不产生H2S。 MIU：无动力、尿素酶阴性、靛基质阴性或阳性。 下列培养物可排除志贺菌： KIA斜面和底部均呈黄色或红色 有动力者 产硫化氢者 尿素酶阳性者 产生气体者（福氏志贺菌6型有时产少量气体） 在18～48小时发酵乳糖的培养物（宋内菌3～5天迟缓分解乳糖） 血清分型 系统生化鉴定 谢 谢 * * 常以甘露醇和乳糖发酵特性来区分志贺菌的生化群 A群：痢疾