猪瘟抗体检测课件.ppt

猪瘟抗体ELISA检测 2015年12月 提 纲 猪瘟抗体检测ELISA原理 一、ELISA概念及类型 50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射性免疫（RIA）分析技术之后，70年代初又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术 1971年此项技术由瑞典学者 Engvall 和Perlmann，荷兰学者Van Weeman和 Schuurs分别报道，将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附测定法（ELISA） 在ELISA方法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”（immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）； （3）酶反应的底物。 几种常用的ELISA检测方法 二、猪瘟抗体检测ELISA实验原理 ☆ 包被板上包被的猪瘟(CSF)抗原，可与待测样品中的特异性抗体（抗-CSFV）反应，形成抗原抗体复合物被吸附到固相上，再加入酶标记的抗猪IgG，形成“固相猪瘟病毒抗原-猪瘟病毒抗体-抗猪IgG-HRP”免疫复合物，洗涤后，如待测样品中含有猪瘟抗体，加入显色液即显色，为阳性；反之为阴性。　 三、实验前准备 常用仪器 洗涤液配置：浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释。 用CSFV样品稀释液20倍稀释待检样品 使用前所有试剂盒组分应恢复到18-26℃，并震荡混匀。 四、猪瘟ELISA操作过程 1、移板：在CSF抗原包被板上加入各100vl阴、阳性对照，阴阳性对照设复空。在相应空中加入100vl已稀释好的样品，封板37℃温育30min。 2、洗板，弃去各空液体，280vl/孔已稀释洗涤液洗涤板空，共洗5次，每次洗涤后弃孔内液，最后一次将板空洗涤液拍干。 3、加酶结合物，每孔100vl，封板37℃温育30min。 4、重复步骤2洗板。 5、每孔加入50vl显色A液和50vl显色B液（也可A、B显色液等比例混合后加入100vl），封板37℃温育10min。 6、每孔加入50vl终止液，终止反应。 7、测量并记录样品和对照的OD值（450nm） 结果分析 1、实验成立条件 阴性对照值=（NC1+NC2）/2 阳性对照值=（PC1+PC2）/2 实验成立条件：阳性对照平均值-阴性对照平均值≥0.1，阴性对照平均值≤0.1。 2、结果判定 样品计算 S/P=(样品-阴性对照平均值）/（阳性对照平均值-阴性对照平均值） S/P值＜0.4,样品判定为CSFV抗体阳性。 S/P值＞0.4,样品判定为CSFV抗体阴性。 五、注意事项 1、基本操作注意事项 1、基本操作注意事项 1、基本操作注意事项 1、基本操作注意事项 1、基本操作注意事项 2、ELISA操作要点 * * 1 3 2 5 4 ELSA基础知识 操作过程 实验前准备 注意事项 ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 双抗体夹心法测抗原（常用） 夹心法 双抗原夹心法测抗体 竞争法测抗原 竞争法 竞争法测抗体 捕获包被法测抗体 亲和素-生物素 ELISA法 间接法测抗体（常用） 加样: 在ELISA中一般有3次加样步聚，即加样本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 保温: 抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(或孵育incubation)。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育？ 以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散