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宁夏医科大学组胚（研究生课程） 组织化学与细胞化学 第一章 组织制片技术与细胞化学技术 组织制片技术：是最为常用的一种标本制作技术，被广泛应用于涉及组织细胞形态结构、细胞组分的定位、定量及其 与功能的关系等相关研究。 细胞化学技术：涉及的范围较广泛。主要包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影技术，示踪细胞化学技术等。 第一节 组织制片技术 切片法：取材固定→脱水包埋→切片染色→封片 石蜡切片 树脂切片 火棉胶切片 非切片法：不经过包埋和切片的步骤 涂片 血液、细胞 铺片 肠系膜 磨片 牙、骨 一.取材 系指细致从生命体获得样品的过程 注意事项和原则： （一）器材准备 锋利 洁净 无污染 （二）处死动物的方法选择 小动物（大、小鼠）---断头或脱颈椎法 较大动物（兔、猫）----麻醉或空气栓塞法 大动物（狗、猪）------麻醉法 （三）取材原则 1.准确 熟悉动物的解剖生理结构 2.快速 一般在动物死后2小时以内取 3.切取 ①切取的组织块应小而薄，大小一般以2cm×1.5cm×0.3cm为好，免疫组化标本大小以1cm×1cm×0.2cm为宜。避免拉锯样动作和挤压样动作 ②皮肤、腔道器官、囊壁组织----切取全层结构 ③骨组织需先脱钙 ④新鲜组织若需保存，先液氮速冻再转入-70 ℃冰箱 4.轻柔 5.低温 4℃ （四）细胞取材及制片 印片法 穿刺法 沉淀法 活细胞标本的制作 二、固定 （一）原理：采用化学试剂配制成固定液，使之渗入组织细胞中，使蛋白变性凝固，不溶于水和有机溶剂，以达到保存组织细胞生活时的结构和抗原性 （二）作用： 1、保持结构形态与生活时相似，防止自溶、 腐败 2、硬化作用，利于切片 3、保持抗原和DNA、RNA 4、媒染作用，使组织细胞更易着色 5、区别不同组织成分 （三）固定的注意事项 根据研究目的不同选择合适的固定剂 MASSON染色---甲醛升汞、Zenker液 保存细胞内糖原---Carnoy液 尿酸盐结晶---无水乙醇 固定液的用量 总体积的5-10倍以上 固定时间的选择 3-24h （四）常用固定液 单一固定液 1．醛类固定剂 10%甲醛，甲醛磷酸缓冲固定液(ph7.2-7.4pbs) 2. 丙酮及醇类固定剂 收缩作用强,乙醇慎用 混合固定液 1.zenker液 光镜研究，最好的固定液。储备液由重铬酸钾2.5克，溶于蒸馏水 加热搅拌使之溶解，再加入升汞5克，冷却后过滤，置于棕色瓶中保存。用时取贮存液95ml,加入5ml冰醋酸，即成zenker液 。 2.Bouin液 冰乙酸、苦味酸、甲醛按1：5:15配置而成 固定方法 浸透固定法最常用 固定后处理 组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。 三.脱水与透明 脱水，就是脱去组织的内水，即借某些溶媒置换出组织内水分的过程。固定后的组织用水冲洗后，组织中充满水分，妨碍石蜡的侵入，必须用不同浓度的酒精将组织中的水分脱净。采用梯度酒精进行脱水（70%-80%-95%Ⅰ-95%Ⅱ-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ）。 脱水后组织中含有酒精，仍不能与石蜡相融，要用二甲苯或氯仿替代酒精，组织经过二甲苯后呈现透明状态，这一过程称为透明。二甲苯处理时间一般为30mim。 注意事项： 各级乙醇脱水时间，可根据组织块的大小适当调整。如中途因故不能进行下去，则可将标本退回到80%酒精中保存。 若组织含水量过多（如胚胎组织），则脱水剂浓度应由更低级乙醇（如30%-40%乙醇）开始。 若脱水不尽，切片后蜡块切面会出现凹陷。这样的蜡块染色效果差，染色是组织也容易脱落 脱水剂容积应为组织块总体积的5-10倍以上。 四.浸蜡、包埋 浸蜡 是指组织块经透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程。为使石蜡充分渗入组织，需经过3次浸渍，期间更换三次石蜡，每次30-60min。第一次浸软蜡（熔点50-52 ℃ ），后两次用硬蜡（60-62 ℃ ）。 注意事项： 浸蜡要掌握适宜恒温，温度略高于石蜡熔点2-3 ℃，一般65 ℃. 浸蜡所用时间可根据组织块的大小适当调整。 熔蜡的容积应为组织总体积的5-10倍以上。 包埋 是指把浸蜡后的组织块，放入装有溶化的石蜡的包埋器中，被包起的过程