蛋白组学概论课件.ppt

* * 在蛋白质组学研究流程中，蛋白质鉴定技术是最关键的部分。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。 * 以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。质谱技术已经是蛋白质组学研究中必不可少的支撑技术。原理：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。 * 一台质谱仪一般有进样装置、离子化源、质量分析器、离子检测器和数据分析系统组成。其中离子化源和质量分析器是两个核心部件，也是发展得最快的两个方面。 * (MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱， * 双向电泳技术、质谱技术和生物信息学是蛋白质组学的三大支撑技术。 * NRDB由SWISS-PROT和GENPETP等几个数据库组成， dbEST是由美国国家生物技术信息中心/欧洲生物信息学研究所(NCBIPEBI)共同编辑的核酸数据库； * :①灵敏度高: 在高浓度靶蛋白存在的条件下,能检测到微弱的蛋白质相互作用;②细胞裂解物中的所有蛋白质与靶蛋白的结合机会均等;③适应于检测多亚基蛋白质之间的相互作用.但是,运用这种方法研究蛋白质相互作用会碰到内源性诱饵蛋白的表达以及非特异结合蛋白质的干扰等问题. 2．基于生物质谱的定量技术 原理：对于具有相同离子化能力的蛋白质或多肽，可以通过比较质谱峰的强度（或峰面积）得到待比较蛋白质的相对量。 二、蛋白质组功能模式的研究方法 揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。 主要研究目标 （一）蛋白质翻译后修饰的研究 翻译后修饰 糖基化 乙酰化 甲基化 羧基化 二硫键 磷酸化 去磷酸化 修饰肽的检测的高灵敏度方法 蛋白质翻译后修饰的定量分析 合适的修饰状态下处理和电离条件 测定工作量巨大 研究面临的困难： （二）蛋白质相互作用研究技术 生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用； 新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现； 细胞信号转导及病原体感染和免疫反应。 1989年Field 和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。 以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。 酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system） 转录激活因子GAL4的特点 N端含NLS和与酵母GAL1基因启动子上游激活序列结合的结构域（BD） C端含GAL1转录激活结构域（AD） 功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录因子活性。 系统构建 构建与GAL4 BD融合的蛋白表达载体 构建与GAL4 AD 融合的蛋白表达载体； 建立带有一个或多个报告基因的酵母菌株 主要特点和优势 高效酵母转化方法操作简单，转化率高； 真实反应体内蛋白质间相互作用情况； 不需分离靶蛋白； 敏感性高。 1. 假阳性结果 2. 假阴性结果 3. 限于核内表达的蛋白质的相互作用 缺 点 噬菌体展示技术 ( phage display ) 将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合 。 主 要 应 用 筛选与特异抗体或受体相互作用的蛋白质 研究抗体或受体的结合位点 构建随机肽库、抗体库和蛋白文库 改造和提高蛋白质的生物学和免疫学特性 研究新型多肽药物、疫苗和抗体 研究涉及到蛋白质与核酸相互作用的生物学过程和新型的基因治疗导向系统 基于质谱的蛋白质相互作用研究方法 靶蛋白制备 蛋白质复合体的纯化 蛋白质复合体的质谱鉴定 基本步骤： （1）亲和