重组体克隆筛选和鉴定.ppt

第七章 重组体克隆的筛选和鉴定 一般克隆与筛选策略 第一节 载体表型选择法 第二节 根据插入基因的表型选择 第三节 DNA电泳检测法 第四节 核酸杂交检测法 第五节 免疫化学检测法 第六节 转译筛选法 第七节 几种常见的真核生物重要基因选择方法 第一节 载体表型选择法 pBR322 2. pBR322抗菌素标记选择 3. 选择过程： （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 二、?-半乳糖苷酶显色反应选择法 2. 选择过程 第二节 根据插入基因的表型选择 2. 增加新性状 第三节 DNA电泳检测法 二、酶切电泳筛选法 筛选过程 三、PCR扩增检测法 第四节 核酸杂交检测法 二、核酸杂交检测方法 （1）菌落原位杂交筛选 （2）R-环检测法 2. Northern blotting 第五节 免疫化学检测法 2. 放射性抗体检测法过程 二、免疫沉淀检测法 三、酶联免疫吸附测定（ELISA） 2. ELISA检测的一般步骤 （2）一抗结合 （3）二抗结合 （4）显色反应 （5）比色 四、免疫印迹（western blotting）法 ② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： ③蛋白质电泳的分子量标准 银染 用放射性同位素或非放射性标记物标记特异性抗体。 将转膜的印迹上的抗原与抗体反应，在杂交膜上显示出明显的杂交信号，则表明受体细胞中存在目的基因表达产物。 ② Blotting ③ Blotting过程 ④结果 第六节 转译筛选法 二、转译筛选 三、杂交抑制转译法 2. 过程 四、杂交释放转译法 2. 过程 第七节 植物转化体报道基因筛选法 选择基因，指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所不具备的新的遗传特性，从而使得人们能够使用特定的选择培养基，将转化的新细胞从亲本细胞群体中选择出来的一类特殊的基因。 主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。它是重组DNA载体的重要标记，通常用来检验转化成功与否 。 培养在含有抗菌素或除草剂的选择培养基上的非转化细胞，便被杀死或是生长受到抑制，而转化细胞则能够存活下来，得到正确选择和鉴定。 选择标记基因 a.抗菌素抗性基因： 　　　新霉素(neomycin) 　　　磷酸转移酶基因潮霉素(hygromycin) 　　　磷酸转移酶基因链霉素(streptomycin) 　　　磷酸转移酶基因庆大霉素(gentamycin) 　　　乙酰转移酶基因 b.抗除草剂抗性基因： 　　　膦丝菌素(phosphinothricin) 　　　乙酰转移酶基因，即bar基因5-烯醇丙酮酰 　　　草莽酸合成酶基因，即EPSP合成酶基因 报告基因，指其编码产物能够被快速地测定、常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。 不依赖于外界压力的一类基因。把它的编码序列与目的基因融合表达后，可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控，是细胞和组织内监测基因表达与蛋白定位的理想标记。 报告基因 　　β-葡萄糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase)基因 　　荧光素酶(luciferase)基因 　　氯霉素乙酰转移酶(chioramphenicol acetyltransferase)基因 　　β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)基因 　　胭脂碱合成酶(nopaline synthetase,nos)基因 　　章鱼碱合成酶(octopine synthetase,ocs)基因 　　乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthetase)基因 　　苏氨酸脱水酶(threonine dehydratase)基因 　　绿色荧光蛋白质(green fluorescent protein)基因 选择标记基因和报告基因功能区别： 选择标记基因：该基因的产物给予植物细胞产生一种选择压力，致使未转化细胞不能生长、发育与分化。 报告基因：强调给转化细胞带上一种标记，起报告和识别作用。 2. 几种报道基因的作用原理 Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP 转入萤火虫的luciferase的烟草 烟草叶片表达B型肝炎抗原 植物细胞中适用的报道基因 mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。 单链mRNA 核糖体 小亚基 核糖体 大亚基 能翻译 mRNA DNA 核糖体 小亚基 核糖体 大亚基 不能翻译 1. 原理 1. 原理： 在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源