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植物病原效应蛋白功能探究方法 　　摘要 植株病原会分泌一些与植物相互作用的效应蛋白，这些蛋白在病原菌与寄主植物互作过程中起着重要作用。结合几种细菌、真菌分泌的效应蛋白研究进展，介绍了用于病原菌效应蛋白研究的试验方法及其独特之处，包括图位克隆、异源表达分析等，提出研究一个单一效应蛋白需要多种分析方法。 关键词 病原菌；效应蛋白；研究方法；作用机制 中图分类号 S432.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）04-0116-02 植物与病原菌相互对抗的过程中，病原菌会分泌一些蛋白到寄主细胞中。这些蛋白被称为“效应蛋白（Avr）”，能够通过多种方式抑制植物免疫反应，促使病原成功侵染植物。植物主要通过2种防御反应来对抗病原菌的侵染[1-2]。一种是通过表面受体（pattern recognition receptor，PRR），如CEBiP和OsCERK1[3]等，识别病原微生物分子相关模式（Pathogen-or microbe associated molecular patterns，PAMPs），激活植物内在免疫系统进行防御，被称为依赖于病原菌识别的免疫激活途径（PAMP-triggered immunity，PTI）；另一种是通过抗性蛋白（R蛋白）识别病原菌分泌的效应蛋白，激活植物免疫系统，被称为效应蛋白介导的激活免疫途径（Effector-triggered immunity，ETI）[4]。随着植物病原效应蛋白基因组测序的完成，采取一定的策略分离、克隆相关Avr基因，对于Avr基因的功能及与寄主植物间的互作机制研究具有重要意义。现结合几种细菌、真菌效应蛋白研究的必威体育精装版进展，综述了病原功能效应蛋白研究策略，提出研究单一效应蛋白需要多种分析方法。 1 图位克隆策略分离效应蛋白 植物病原效应蛋白基因间的同源性较低，其表达蛋白的结构功能及生化性质尚不清楚，因此，目前克隆效应蛋白基因的主要策略是图位克隆法[5]。图位克隆（Map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），是一种建立在分子标记图谱基础上的基因分离和克隆技术。迄今为止，稻瘟菌中已有40多个效应蛋白基因被鉴定，其中Pwl1、Pwl2、AvrPiz-t、Avr-Pita和Avr1-CO39都是通过图位克隆得到的[6-9]。AvrPiz-t是Li等在毒性菌株81278ZB15中分离，并通过基因精细定位及互补实验证实AvrPiz-t的存在。Orbach等（2000）结合RFLP标记定位与染色体步行方法从菌株O-137克隆分离了Avr-Pita。该基因编码一个全长为223个氨基酸的中性锌金属蛋白酶，其成熟蛋白仅176个氨基酸，能与Pi-ta特异结合。但是，由于寻找与效应蛋白无毒基因紧密连锁的分子标记、构建基因组文库是图位克隆法中最为关键的2个环节，这使得传统的图位克隆法存在周期长、效率低等缺点。随着稻瘟病菌全基因组测序的完成和信息生物学的发展，Yoshida等[10]于2009年利用关联遗传学结合基因组序列信息的方法，揭示了3个新型稻瘟病菌无毒基因，为更快捷、更高效完成效应蛋白基因的克隆提供新的方向。 2.2 异源表达分析鉴定功能效应蛋白 2.2.1 农杆介导的瞬时表达方法。农杆菌介导Avr蛋白的瞬时表达是植物转化中最常用的方法。其中，利用农杆菌注射瞬时表达能够快速、简便地用于效应蛋白功能的初步鉴定。通过Avr基因与CaMV 35S启动子共表达，能在植物单一叶片同时高水平表达几个重组载体，其瞬时性避免了构建稳定表达载体的耗时过程，能在1～2 d完成。对于病原体，寄主细胞中的效应蛋白的活性是触发ETI及其随后HR反应的先决条件。因此，农杆菌注射植物叶片的瞬时转化可以用于抗性植物的无毒活性的研究[11-13]。Kim等（2002）利用带有或不含有Pto基因的番茄植株瞬时转化发现AvrPtoB的表达只有Pto存在时才引起细胞死亡。Chen 等（2013）结合水稻原生质体瞬时表达和农杆菌注射本生烟叶片的方法，对5个可诱导植物细胞坏死的新型Avr蛋白MoCDIP1-5进行了鉴定。另一种则是通过叶肉原生质体瞬时表达植物表达效应蛋白。尽管原生质体缺乏成熟细胞壁，但它们对完整叶片中找到的大多数模拟激发子都产生反应。而且，原生质体表达能在没有细菌及其相关PAMP存在下转化植物细胞，检测单一PAMP信号。在原生质体中，PAMP感知导致的基因表达的变化可用一个荧光素酶报告系统进行研究[14-15]。Ribot等（2013）结合GUS等报告基因，原生质体瞬时表达表明，Avr1-CO39在带有Pi-CO39的水稻中能触发HR过敏反应类细胞死亡。但是，用这一系统只能进行分子或生化性质研究，不能完整地反应