免疫组化、免疫荧光、流式细胞术得应用比较及常见问题分析.ppt

流式细胞仪工作原理图 流式细胞术实验过程 细胞悬浮液制备（浓度为1～5×106个/ml） 细胞固定（合适的固定液，如4%甲醛溶液等） 细胞膜穿透（ 冰冷的甲醇等） 封闭（3%BSA-PBS等） 一抗孵育 荧光二抗孵育 流式细胞仪分析 人外周全血细胞双参数散点图 直方图：单参数分析 流式细胞术常见结果分析 散点图：多参数分析 常用细胞表型及意义： （Cluster of Differentiation, CD） CD3 总T细胞 CD4 T辅助/诱导细胞亚群 CD8 T抑制/细胞毒细胞亚群 CD19 B细胞抗原 LL: CD3-CD4- B细胞群+细胞毒T细胞亚群 LR：CD3+CD4- 细胞毒T细胞亚群 UR：CD3+CD4+ T辅助细胞亚群 UL 0.70 UR 24.2 LR 22.3 LL 52.80 荧光补偿示原理 荧光补偿是指修正荧光渗漏的过程，如从探测器出去除匹配荧光以外的任何荧光信号。 当采用两种或两种以上荧光标记时（如FITC,PE），当携带两种荧光素的细胞受到激光照射激发时，将发出两种不同波长的荧光。然而，荧光染料所发出的荧光都具有一定的波长范围（宽发射谱性质），虽然各自的荧光峰值不同，但发射谱范围会有一定的重叠。因而就会造成不同通道之间的荧光干扰，对实验结果造成影响。 荧光补偿示意图 Annexin V-FITC/PI凋亡检测原理 在细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。 Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸PS高亲和力特异性结合。 将Annexin V进行荧光素（FITC、PE）或Biotin标记，以标记了的Annexin V-FITC作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在细胞凋亡中晚期的细胞和死细胞，碘化丙啶PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将细胞凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 图片引自 /experiment/cellular4/80861.shtml? Annexin V-FITC /PI 凋亡检测结果分析 荧光强度/背景过高 一抗/二抗浓度太高，建议降低一抗/二抗浓度。 封闭不完全，建议增加蛋白封闭时间。 洗涤不充分，建议增加冲洗次数与时间。 信号弱或无信号 无目的蛋白或表达量极少，建议选用表达量高的细胞。 细胞通透性差，建议增加通透剂的作用时间或浓度。 一抗/二抗浓度太低，建议增大其浓度。 二抗选择错误（种属不匹配），建议选用与一抗种属相匹配的二抗。 柱形图分析时出现荧光双峰 抗原本身特性所决定（比如不同时期的细胞蛋白表达量不同） 进样针堵塞，建议清洗管路。 进样速度太快，建议调低进样速度。 管路系统偏移导致焦距偏离，建议请专业维修人员校准。? 流式细胞术常见问题分析 IHC、IF、FC区别与联系 FC IHC/IF 控制 电脑（客观） 人（主观） 结果显示方式 荧光激发后被探测子捕获信号 化学显色/荧光通过显微镜观察拍片 样本 单细胞（或颗粒）悬液（流动） 组织切片/细胞爬片 （静止） 细胞数量 大（上万个） 小 样本利用 分选后可回收利用 不可回收利用 结果揭示信息 细胞群体特征分布 揭示细胞内部结构信息 功能 可同时检测多个参数 一般只能检测一个参数 * 免疫组化、免疫荧光、 流式细胞术的应用比较 及常见问题分析 宋砚明 song_yanming@ 免疫组化（IHC）的应用介绍 免疫荧光（IF）的应用介绍 流式细胞术（FC）的应用介绍 IHC、IF、FC区别与联系 免疫组织化学原理及特点 利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记技术，通过化学反应使标记抗体显色，对组织细胞内的特异性抗原进行定位、定性、定量检测的一门技术。 免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高，定位准确，形态与功能相结合等特点。 免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC） 细 胞 抗原 一抗 二抗 辣根过氧化物酶（HRP） 3，3-二氨联苯胺（DAB）显色剂 棕褐色络合物 IHC反应原理示意图 组织切片/芯片制作 2. 组织芯片应用领域 组织芯片的应用领域包括与生命科学相关的基础研究、临床研究、应用研究和新药开发等。 免疫组化染色（IHC）； 原位杂交（ISH）； 荧光原位杂交（FISH）； 原位末端标记分析（TUNEL）； 原位PCR 以及激光捕