人类外周血培养及染色体核型分析.doc

人类外周血培养及染色体核型分析 一、 实验目的： 1.学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法； 2.利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本； 3.利用人类染色体核型分析软件进行核型分析。 二、实验原理： 1、植物血凝素的作用 外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素(PHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，进而开始进行有丝分裂。 2、秋水仙素的作用： 秋水仙素(colchicines)可以抑制细胞纺锤体的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。因此利用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细胞。 使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度上的收缩，因此在处理时间和浓度上要合适。 3、低渗的原理： 徐道觉(T.C.Hsu)等于1952年发现在固定细胞之前使用低渗液进行处理，可以使细胞的核膜吸水膨胀，滴片后细胞破裂，染色体分散开来，在显微镜下易于观察和统计，染色效果也明显提高。 这种技术被广泛采用后，使人类染色体分析技术得到了发展。 4、核型和带型： 核型(karyotype)： 是指染色体组在有丝分裂中期的表型, 是染色体数目、大小、形态特征的总和。 在对染色体进行测量计算的基础上, 进行分组、排队、配对, 并进行形态分析的过程叫核型分析。 将一个染色体组的全部染色体逐条按其特征画下来，再按长短、形态等特征排列起来的图称为核型模式图，它代表一个物种的核型模式。 带型（banding pattern） 即染色体带型。借助细胞学的特殊处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性，所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带型。 常用的显带技术所显示的带有Q带、G带、C带、R带、T带等。就每一种分带技术而言，每一染色体的带型是高度专一和恒定的。 三、实验用具及试剂： 实验仪器及用具： 恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱 、冰箱 、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析仪； 培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、离心管(10ml)、载玻片、烧杯、量筒。 2. 实验试剂： 外周血淋巴细胞培养基 2%碘酒 75%酒精 20μg/ml秋水仙素 0.075 mol/L KCl溶液 甲醇 冰醋酸 Giemsa原液 1/15 mol/L磷酸缓冲液 四、实验步骤： 1、采血：将皮肤常规消毒后静脉采血约 0.5 ml。 2、种血及培养：将采到的血样立即接种到培养瓶内，每个培养瓶接25－28滴（约0.5ml），轻轻摇匀后将培养瓶放在37℃温箱中培养72小时。培养过程中，每天应轻轻摇动两次培养瓶。 3、秋水仙素处理：在终止培养前4小时，向培养瓶中加 20μg/ml的秋水仙素20μl，轻轻摇匀后继续培养到72小时。 4、制片： （1）离心：从温箱中取出培养瓶，用吸管将培养液转入10ml的刻度离心管内。2000转/分，离心10分钟。 （2）低渗：弃去上清液。加入37℃预热的 0.075mol/L KCl低渗液6-8ml，用吸管轻轻吹打均匀，放在37℃恒温水浴中30分钟。(此时配固定液：甲醇225ml+冰醋酸75ml ) （3）预固定：在离心管中加入现配的预温的甲醇-冰醋酸(3:1)固定液约1ml，轻轻混匀, 37℃固定15分钟。 （4）再次离心：2000转/分离心10分钟。 （5）第一次固定：弃上清液，加入固定液约7ml，立即用吸管吹打使之成细胞悬液，室温固定20分钟。 2000转/分离心10分钟。 （6）第二次固定：同第一次固定。 （7）弃上清液，根据沉淀量的多少，加入适量固定液6～8滴，用吸管吹打使均匀后制成细胞悬液。 （8）滴片：在10-15cm高处将细胞悬液滴在预冷的载玻片上，注意动作应迅速，避免载片升温。 （9）染色：用10%吉姆萨染液扣染30分钟，染色结束后用清水将浮色冲去，干燥后即可进行镜检。 （10）照相：在显微镜下寻找分散较好的分裂相(核型)，再置于显微照相仪下拍摄照片，并保存。 （11）核型分析：应用核型分析软件，进行染色体核型分析。 五、注意事项: 1、秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。 2、低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。 3、离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；