免疫印迹实验技术.ppt

免疫印迹与免疫沉淀 2011年6月27日 免疫沉淀原理 免疫沉淀相关派生技术 ● 免疫共沉淀（protein complex immunoprecipitation, CoIp）：研究蛋白-蛋白相互作用 ●染色体免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation, ChIp）：DNA-蛋白质相互作用 ●染色体免疫沉淀芯片（ChIp-on-chip）：利用芯片技术高通量研究DNA-蛋白质相互作用 ●RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation）：RNA-蛋白质相互作用 免疫印迹技术的原理 Western blot是将蛋白质样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，通过抗体-抗原相互作用进行特异性检测的方法。 电泳 转膜 抗体孵育 显影 SDS——蛋白质分离 SDS示意图 总蛋白染色（考马斯亮蓝） 转 膜 转印膜 尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 转膜方式 湿转 半干转 湿 转 转膜时间：200 mA, 1 h 丽春红染色鉴定转膜情况 10X丽春红染液：丽春红S 2g、 三氯乙酸30g 和磺基水杨酸 30g 加 水至100ml 染色方法：将膜放入染液中5 min，后在水中脱色2 min 脱色：在水中浸泡10 min 丽春红对膜上蛋白质的染色是可逆的！ 封 闭 膜上没有结合蛋白的空白位置需要加以封闭，以避免与抗体的非特异性结合。过度的封闭会导致目的抗原表位的遮蔽，从而降低灵敏度，不完全封闭会导致最终背景增高或信噪比降低。 封闭液：含有5%脱脂奶粉的TBST 封闭时间：室温1 h 抗体孵育和显影 抗体孵育 一抗直接测定：膜背景低、简单、快速 二抗间接测定：可能有交叉反应，灵敏度高 二抗标记物：辣根过氧化酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、生物素、荧光素 酶与底物的孵育 显色底物：DAB底物在HRP和过氧化氢存在下，失去电子而显出棕色 发光底物：HRP与底物反应发出强光，可见光信号可用压片法检测 结果检测 DAB显色 对膜进行直接扫描、分析 荧光标记二抗 发光底物 用X光胶片来进行曝光检测，显影后对胶片进行扫描、分析