分子生物学实验技术及原理.ppt

05级 分子生物学实验 分子生物学实验技术及原理 授课教师 马景蕃 授课班级 05生技班 参考书目 基因工程原理（上、下） 吴乃虎 现代分子生物学 朱玉贤 分子生物学 阎隆飞 实验一 大肠杆菌感受态制备及转化 实验目的 1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。 3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。 实验原理 转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。 转化中的受体细胞 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。 实验原理 转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法 感受态细胞：的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。 实验原理 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。 影响转化率的因素 细胞生长状态和密度。 转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。 实验仪器 实验试剂 ? 大肠杆菌DH5α ? LB培养基， ? 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷） ? 氨苄青霉素 pUC18质粒 实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备 外源DNA的转化 实验步骤 菌株活化 1．用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时 2．挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时 3．将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4 实验步骤 感受态细胞制备 4．将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min 5．4000rpm离心5min,弃上清 6．加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min 7．4000rpm离心5 min,弃上清 8．加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15％的甘油 可－70℃长期保存 实验步骤 转化 9．??? 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min 10．??于42℃水浴90S 11．??冰上放置2min 12．??加入800μlLB液体培养基于37培养1小时 13．??将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 14．?将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果 对照组 转化率 实验报告 写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂 详细列出实验步骤； 画出实验结果的示意图并做分析，计算转化效率。 实验二 质粒DNA的提取及酶切 一．实验目的及背景 质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。 质粒特点 质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子. １９５２年由Lederburg正式命名为质粒。 质粒类型 质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒 和 严紧型质粒 1.松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。 2.严紧型质粒 严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。 质粒的应用 大多数基因工程使用松弛型质粒。 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物