口腔医学技术专业论文口腔修复毕业论文口腔内科论文综述：口腔黏膜真菌鉴定方法的比较.doc

口腔医学技术专业论文口腔修复毕业论文口腔内科论文综述Image Pro Plus 4. 5 software (Media CyberneticsInc., SilverSpring, MD, USA) DYY-8B型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂),蓝盾TM551可见光凝胶电泳-透射仪(Bio-V,厦门百维信生物科技有限公司), 80-1离心机(上海手术器械厂)。 1.2　方法 1. 2. 1　真菌样本采集　 用无菌牙签采集后牙邻间隙牙菌斑样本于Ep管中, -20℃保存。同时检查记录受检者年龄、性别、学历、吸烟、饮酒习惯、口腔健康状况。 1. 2. 2　真菌分离培养 牙菌斑样本加入200μL生理盐水吹打混匀,吸取20μL菌液接种于沙保罗琼脂平板, 37℃培养24 h。用无菌牙签收集菌落于Ep管中。 1. 2. 3　微量培养法 　在吴绍熙方法[5]基础上加以改进,在已高压灭菌的玻片上用微量加样器取10μL熔化的1%吐温-80玉米琼脂培养基,凝固后用接种针水平穿刺接种培养得到的待检菌株,无菌湿盒内35℃孵育24~72 h,待菌生长后滴加10 g/L的美蓝100μL使芽管和孢子着色,盖上盖玻片,置于镜下观察。 1. 2. 4　CHROMagar念珠菌显色培养基鉴定法 　参照文献[6],按照产品说明书操作,根据鉴定培养基上菌落的形态和颜色判断不同的菌种。 1. 2. 5　糖发酵生化反应鉴定法　 各样本菌株进行葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖发酵生化反应鉴定,鉴别标准参见文献[5]。 1. 2. 6　PCR-RLFP鉴定法 　取融冻的牙菌斑标本提取各菌株的DNA; PCR扩增, PCR反应循环条件:预变性94℃热启动5 min,变性94℃30 s,退火55℃30 s,延伸72℃45 s,共40个循环,最后延伸72℃10 min;配置2%琼脂糖凝胶,核酸染料染色,倒胶,预染,上样, 110 V 30 min电泳,紫外线凝胶扫描成像。RFLP(Restriction fragmentlength polymorphism)酶切方法按照Msp I限制性内切酶产品说明书操作,取10μL酶切产物, 2%琼脂糖凝胶电泳, 110 V 30 min电泳,紫外线凝胶扫描成像。不同的假丝酵母菌菌种被酶分离出不同的片段长度,产物鉴定标准[7]。 1. 2. 7　ITS序列分析菌种鉴定　 取ITS1-ITS4的30μLPCR扩增产物(总量1~2μgPCR产物),送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果用Blast有哪些信誉好的足球投注网站程序提交GenBank。 1. 2. 8　统计学分析　 采用SPSS11. 5软件进行统计学处理, 5种鉴定假丝酵母菌种的方法阳性率比较用χ2检验,当T5时用Pearson Chi-Square分析, 1T5时用Continuity Correction分析,P0. 05为差异有统计学意义。 2　结　果 2.1　微量培养法鉴定 　37例真菌菌株样本在玉米吐温-80琼脂上镜检可见类圆形厚壁孢子,部分有明显假菌丝。4例热带假丝酵母菌镜下见分枝菌丝,无厚壁孢子。3例近平滑假丝酵母菌镜下观察见小分生孢子, 1例乙醇假丝酵母菌培养后见长棒状孢子。其他标本镜下观察不典型。该法检测正常人群口腔假丝酵母菌阳性检出率占20% (46/230)。 2. 2　CHROM agar假丝酵母菌显色培养基检测 　可鉴别出9株白假丝酵母菌(草绿色),4株热带假丝酵母菌(蓝灰色),10株近平滑假丝酵母菌(淡粉色),其余7个菌株分别呈粉色、白色、粉紫色,颜色接近难以鉴别。该法检测正常人群口腔假丝酵母菌阳性检出率占13% (30/230)。该法和基因测序法热带假丝酵母菌检出一致率为80% (4/5),2种方法检出近平滑假丝酵母菌完全相符,皆为10例。 2. 3　糖发酵生化法检测　 　该法阳性标本占被检出真菌例数的46.4%(26/56)。 2. 4　ITS基因的PCR-RFLP鉴定　　 白假丝酵母菌和热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌均被Msp I分离出2个片段大小各不相同的条带,季也蒙假丝酵母菌被酶切分离出3个条带,近平滑假丝酵母菌则在酶切前后保持相同的片段。该法鉴定正常人群口腔假丝酵母菌阳性结果和基因测序结果一致率为91%。 2. 5　ITS基因测序鉴定　 　测序结果阳性真菌50株,GenBank已提供45个菌株的序列登录号,每个菌种选取其中的1例,见表2。各菌种阳性率分别为白色假丝酵母菌51. 8% (29/50),近平滑假丝酵母菌17. 9% (10/50),热带假丝酵母菌8. 9% (5/50),克柔假丝酵母菌1. 8% (1/50),乙醇假丝酵母菌1. 8% (1/50),季也蒙假丝酵母菌3. 6% (2/50),Lodderomy-ces elongispor