原核表达及蛋白质的纯化与浓度测定.ppt

操作步骤 通过PCR或RT-PCR获得目的基因 构建重组表达质粒 获得含重组表达质粒的表达菌种 诱导表达  亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。 不溶性包涵体的提取 诱导200mL菌体，4℃ 12000rpm离心1min集菌，PBS洗涤菌体2-3次，然后用Buffer A（一般用1/10体积）重悬菌体，超声破碎至清亮。 4℃ 12000rpm离心20min，弃上清。 用PBS洗涤沉淀2-3次。 往沉淀中加19.7ml Buffer A以及19.7ul的DTT(终浓度为0.5mM/L)及0.3ml 20%的SKL贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，4℃静置过夜。 Tips 透析第一天更换TE buffer次数稍多一些，换5次 左右，后两天的次数可减少，早中晚各一次。 使用前沸水煮5min即可，冷却后装样，加样时要  带手套，防止手上油脂堵塞透析袋的孔，影响透  析效果。用时要检查是否会有液体的漏出，使用 后的透析袋应浸泡在20%的酒精中。 若蛋白浓度太高，在透析的过程中会有蛋白的析 出，建议在加入透析袋之前做等量体积的稀释。 透析之后的蛋白分装到EP管中，既避免浪费，又 可避免蛋白因反复冻融而影响自身的活性。 GST标签蛋白的纯化 诱导200mL菌体，4℃ 12000rpm 离心1min集菌，然后用 PBS洗涤诱导后的菌体2-3次，Buffer A（一般用1/10体 积）重悬菌体，超声波破碎至清亮 ，12000rpm离心 20min取上清，在上清中加入适量经处理过的50%的 Glutathione Sepharose 4B，室温摇床轻轻晃动作用1h，使 蛋白充分吸附。 2000 rpm离心5min，弃上清。 加入至少10倍体积PBS，轻摇至Glutathione Sepharose 4B 悬浮于溶液中，2000rpm离心5min弃上清。 重复上步两次。 Tips 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA等。 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，如DTT，  防止二价Ni被还原。 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失。 建议在破碎细胞的时加入蛋白酶抑制剂，如0.1- 1mM的PMSF，防止目的蛋白被降解。 * * 原核表达 实验原理 大肠杆菌是重要的原核表达体系,在重组 基因转化入大肠杆菌菌株以后，通过温度 的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白 质，然后将表达样品进行SDS以检测 表达的蛋白质。 实验室常采用IPTG诱导外源基因表达，不 同的表达质粒表达方法并不完全相同，由  于启动子不同，诱导表达要根据具体情况  而定。 诱导表达 挑取含重组质粒的菌体单克隆至5ml含相应抗生素的LB液体培养基中37℃振荡过夜培养。（同时以空载体作为对照 ） 按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌液接入到100ml LB液体培养基中，?37℃振荡培养2-3h。 取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入诱导剂 IPTG至终浓度0.8mM作为实验组，37℃继续振荡培 养3h，4h，5h，6h 。 剩余的样品（约95ml）然后12000rpm离心1min，用 灭菌水重悬菌体，用低温超高压细胞破碎仪或超声 破碎仪破碎重悬的菌体，4℃ 12000rpm离心10min ， 上清倒入另一管中，沉淀用10ml的灭菌水重悬，然后 分别取40ul，加入5×蛋白上样缓冲液10ul混匀， 沸水煮5min，做SDS等分析。 不同时间点分别取1ml菌体，12000rpm离心1min 或8000rpm离心6min收获菌体沉淀，用40ul灭菌水 重悬沉淀，加入5×蛋白上样缓冲液10ul混匀， 沸水煮5min。 Tips 与超声波破碎仪相比，低温超高压连续流细胞破碎仪的优点有： 不同菌体的破碎最适压力是不同的。 例如：一般大肠杆菌的破碎压力为1000mpa，压力过大可能会对蛋白的活性有影响。 保持细胞活性（4-6℃的环境） 省时 选择表达宿主之前，要先对靶基因中的密 码子进行分析。 如果有细菌不常用的密码子，需要考虑更换表达菌株。例如:不能使用BL21(DE3)进行表达，可以选择Rosetta系列菌株，如Rosetta 2。这种