发酵分析—色谱分析概述.ppt

色谱分析 第一节 色谱法概述 一、 色谱法的特点、分类和作用 色谱法的特点 色谱法的分类 1．按两相分子的聚集状态分类 色谱法分类（续前） 2．按固定相的固定方式分类 3．按分离机制分类 二、色谱过程、分离原理及特点 ㈠色谱过程 指被分离组分在两相中的“分配”平衡过程 以吸附色谱为例见图示 吸附→ 解吸→再吸附 →再解吸 →反复多次洗脱→被测组分分配系数不同→ 差速迁移 → 分离 图示 分配系数的微小差异→吸附能力的微小差异 微小差异积累→较大差异→吸附能力弱的组分先流出；吸附能力强的组分后流出back ㈡色谱分离原理 色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异 平衡分配可以用分配系数和分配比来衡量 ㈢色谱分离特点 1．不同组分通过色谱柱时的迁移速度不等 →提供了分离的可能性 2．各组分沿柱子扩散分布→峰宽 →不利于不同组分分离 三、色谱流出曲线与术语 （2）用体积表示的保留值 3. 区域宽度 四、分配系数与色谱分离 ㈠分配系数和容量因子：相平衡参数 分配系数K(平衡常数)：指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动相中的浓度比（色谱过程的相平衡参数） 思考题 色谱分离的原理及过程。 1、基本原理 薄层层析法是色谱分析技术的一种 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同组分的吸附力不一样，不同组分在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来） Thin-Layer Chromatography: A Two-Component Mixture Thin-Layer Chromatography: Determination of Rf Values Thin-Layer Chromatography: Qualitative Analysis 固定相：氧化铝 2、操作步骤—薄层板的制备 1、调浆 称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状。 2、涂布 取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 3、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。 4、活化 70℃烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。 Rf = 纸色谱 定义： 纸色谱分离法又称纸层析法，是根据不同物质在两相中的分配系数不同而进行分离的一种微量分离方法。 思考题 简述TLC的操作步骤。 （二）离子交换色谱 概念：离子交换分离法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间所发生的交换反应进行分离的方法。 仪器设备简介 离子交换全套装置 聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂的制备 离子交换树脂的形状结构示意图 离子交换拄层析操作方式 一、离子交换剂的处理、转型和再生 二、分离物质的交换 三、物质的洗脱与收集 一、离子交换剂的处理和转型 一般程序：水泡，悬浮，酸或碱浸泡，洗涤至中性 疏水性离子交换剂 用2-4倍的2mol/L NaOH或2mol/L HCl溶液处理 亲水性离子交换剂 用0.5mol/LNa0H或0.5mol/LHCl溶液处理； 转型与再生：由一种反离子转到另一种反离子的过程。 欲使阳离子交换剂转成钠型时，则需用NaOH处理；欲使其转成氢型时，则需用HCl处理；欲使其带铵离子时，则需用NH4OH或NH4C1处理。 二、物质的洗脱与收集 梯度混合器及形成的梯度变化 离子强度梯度洗脱 pH值梯度洗脱 产生梯度溶液的三种装置及形成的梯度变化 线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清白蛋白的图谱 在pH3左右,AA与阳离子交换树脂的结合牢固程度： 碱性AA中性AA酸性AA。 洗脱顺序则是： 酸性AA 中性AA 碱性AA 离子交换树脂结构 骨架：接有功能基团，本身是惰性 功能基团：连接在骨架上，可与相反离子结合 待交换分子：在吸附阶段可与活性离子交换，与骨架上的功能基团结合 活性离子：与功能基团所带电荷相反的可移动的离子 活性离子为阳离子，称阳离子交换树脂，与阳离子发生交换 活性离子为阴离子，称阴离子交换树脂，与阴离子发生交换 717阴离子树脂 聚苯乙烯——N+（CH2）4 ·Cl- 732阳离子树脂 聚苯乙烯—————SO3-· Na+ DEAE-纤维素 纤维素-O-（CH2）2-N+H（C2H5）2 ·Cl- CM-纤维素 纤维素 —O—CH2——COO- ·Na+ 商品名 基质 电荷基团 反离子 带正