干旱盐碱胁迫下禾本科植物谷胱甘肽还原酶的活性.ppt

答 辩 人：关 春 龙 专 业：生物工程 干旱、盐碱胁迫对苗期羊草GSH-Px活性的影响 指导教师：崔 喜 艳 吉林农业大学生命科学学院生物工程专业 材料与方法 结果分析与讨论 结论与致谢 目录 前言 羊草（Leymus chinesis）是多年生根茎型禾本科植物，具有无性繁殖能力强、生产力高、耐干旱、耐贫瘠、耐盐碱等生物生态学特性。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH一PX)即谷胱甘肽:H2O氧化还原酶,分子量7600~9600，是一种水溶性四聚蛋自酶，其四个亚基处在一个平面上，且均有一个硒原子。具有催化活性的硒半胱氨酸位于酶分子178个氨基酸的第35位置上，在酶分子表面凹穴的活性部位，易于接触有机氢过氧化物并使其还原为有机羟化物;GSH一PX也可使H2O2变成H2O，以消除氧化胁迫。还原型谷胱甘肽(GSH)在催化反应中作为氢供体，氧化型谷胱甘肽(GSSG)在谷胱甘肽还原酶(GSSG一R)作用下，还原成GSH。 本研究以不同盐碱化程度及干旱程度下的羊草为试验对象，探讨羊草体内谷胱甘肽过氧化物酶对盐碱和干旱环境的活性，进一步揭示羊草抗干旱、盐碱及适应不同生镜的机制，力求为治理退化草地提供理论依据 材料与方法 实验材料与材料培养 1.羊草 2.吉林农业大学生命科学学院生物化学515研究室，RXZ型智能人工气候箱 材料培养方法与管理 1. 盆栽砂培 2.人工气候箱培养，出苗前每天上午8:00-8:30分浇去离子水50mm透灌，苗出齐后浇Hoagland营养液，照光时间12h(早7:00-晚19:00)。白天温度为28℃±2℃，夜间温度为16℃±2℃ 1 2 材料与方法 实验材料处理方法 出苗2周后，每天下午4:00-4:30分，对不同品种分别用盐碱水、PEG 6000处理1.2.3天。每天浇适量的水以补充蒸发耗分。不同时间处理的品种都有对照（CK），单纯用Hoagland全营养液透灌 实验材料取样方法 处理时间到后，选择均匀一致的3盆测定样品，分别剪取叶片，洗净根后液氮速冻，-20℃冰箱保存备用 3 4 盐碱水、PEG6000的配置及浓度 2 3 4 6 5 1 1.试验方法 用0. 2 mo l /L pH 6. 2的磷酸缓冲液 ( 含 1 mmo l/L EDTA-2Na，5%的水溶性PVP)作为谷胱甘肽过氧化物酶（GSH一PX）的提取介质，偏磷酸为酶促反应的蛋白质沉淀剂, 二硫代对二硝基苯甲酸 (DTNB ) 与 GSH显色反应3min, 在412 nm测定酶管和非酶管的OD值, 以测定谷胱甘肽过氧化物酶的活性。 测定项目与方法 3 1 6 5 4 2 2. 测定时间 苗期；试验数据采用3个重复的平均值±标准差，用DNS软件进行数据分析 测定项目与方法 2 3 1 6 5 4 测定项目与方法 3.试剂的配制 a．迭氮钠-磷酸缓冲液（NaN3-PBS，PH7.0）:2.5mmol/L NaN3，0.2mmol/L EDTA-2Na，0.2mol/L Na2HPO4和0.2mol/L NaH2PO4。 b.偏磷酸沉淀夜：含1.67%HPO3，0.05% EDTA-2Na，28%NaCl。 c.0.61mol/L 三氯乙酸（TCA）。 d.0.32mol/L Na2HPO4。 e.1.0mmol/L GSH溶液（当日配制）：3.07mgGSH用NaN3-PBS溶解至10ml。 f.1.5mmol/L H2O2（当日配制）：取30% H2O2 15μl，以双蒸水定容至100ml。 g.DNTB显色液：DTNB 20mg加1%柠檬酸三钠50ml溶解 2 3 1 6 5 4 测定项目与方法 4.蛋白质与GSH标准曲线的制作 吸取样品液1.0ml于试管中，加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色测定光吸收度并通过标准曲线查得蛋白质含量。 样品中的蛋白质含量（mg/g）=C×VT/VS×WF×1000 式中：C—查标准曲线值，μg；VT—提取液总体积，ml；VS—样品鲜重，g；WF—测定时加样量，ml 取上述标液1. 6ml,加0. 32 mol/ LNa2HPO4 2. 0 ml和DTNB 0. 4 m l,显色5min,于412nm比色,同双蒸水调零。以OD值为纵坐标, GSH浓度为横坐标,制标准曲线 2 3 1 6 5 4 测定项目与方法 5.酶液的提取 分别取经盐碱和干旱处理过的新鲜羊草幼苗叶片及根茎，0.5g加入0.2mol/Ld的磷酸缓冲液（含1mmol/L EDTA-2Na，5%的水溶性PV P, pH 6. 2) 5 m l, 冰浴中研磨成匀浆, 4000 r /min离心10mi