第三章： 无菌技术.ppt

多数无牙孢的杆菌80~100℃下几分钟就几乎全部死亡，但在70℃下需10~15min才能致死，而在60℃下必须30min以上才被杀死。霉菌的孢子通常86~88℃加热30min即可死亡。但一些细菌的芽孢耐热性极强，在100℃下30min还能生存。所以，灭菌彻底与否，一般以杀死细菌的芽孢为标准。 （细菌）芽孢（真菌）孢子英文单词spore,芽孢是一种为了抵抗不良环境条件产生的休眠体，遇到是以的环境再萌发为细菌。如炭疽芽孢杆菌的芽孢就是炭疽产生的，可以在土壤中生活十年以上。细菌的芽孢（如果你爱叫孢子就叫孢子吧）和真菌的孢子不一样，不是繁殖体，而是休眠体，本身几乎不进行新陈代谢 .真菌的孢子是真菌的繁殖体，它在真菌生长到后期或者是生存环境变恶劣时产生，刚产生的孢子几乎没有新陈代谢，只是作为真菌的种子存在。真菌孢子能抵抗很恶劣的环境条件而存在，很难被杀死，它能让真菌度过很恶劣的环境。当外界条件合适时，孢子就会萌发，长成真菌。 * * 培养基的灭菌　培养基在制备过程中带有各种杂菌，分装后应立即灭菌，至少应在24小时之内完成灭菌工序。一般少量的液体只要20分钟就能达到彻底灭菌（实验显示3L以内的液体只要20分钟就能彻底灭菌。 ），如果灭菌的液体量大，就应适当延长灭菌的时间。 ?由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所以灭菌的时间也要适当考虑。对高压灭菌后不会变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用瓷碟、器械等，可以延长灭菌时间或提高压力。只有培养基要求比较严格，既要保证灭菌彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，因此不能随意延长时间和增加压力。琼脂在长时间灭菌后凝固力会下降，以致不凝固。 继代培养更换下来的瓶子和生根苗种植后剩下的瓶子，其中的旧培养基都极易引起污染，应及时清洗，不应放在那里让杂菌孳生，传播扩展，危及其它。 ?高压灭菌锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号，可按工作规模选用。大型效率高，小型的方便灵活。一般使用时应先检查有无裂缝破损，盖子是否严密等，如无问题，先在锅内加水，加水量应按说明书上要求，通常加到与锅底的支架平齐(手提式和立式)。加水后即可加热，将内锅放入，在内锅里放入要灭菌的容器，上面应留有30%的空间，不可装得太满，否则因压力与湿度不对应，造成灭菌不彻底。如三角瓶等间隙较大，可以多放一点。 （1）流通蒸气灭菌法：利用常压下的流通蒸汽进行灭菌。 　　（2）间歇蒸汽灭菌法：利用反复多次的流通蒸汽加热，杀灭所有微生物，包括芽胞。方法同流通蒸汽灭菌法，但要重复3次以上，每次间歇是将要灭菌的物体放到37℃孵箱过夜，目的是使芽胞发育成繁殖体。若被灭菌物不耐100℃高温，可将温度降至75℃～80℃，加热延长为30～60分钟，并增加次数。适用于不耐高热的含糖或牛奶的培养基。 * 无火焰高温灭菌器 * * 干热灭菌注意事项:1\最好在白天进行. 2.灭菌设备要用锡箔纸而不能用牛皮纸等报裹 小型电热石英砂灭菌锅 * * * 培养基配制过程中，如遇到某些化学物质，经高温高压而易于分离减效或失效的可以采用细胞过滤器进行过滤灭菌。将一次性过滤头和一次性无菌注射器配套使用来过滤除菌,先将待过滤溶液吸入注射器,然后通过压力使溶液经过滤头(其中含有孔径为0.22微米的滤膜)下的无菌容器,这样就完成了.如果需过滤的溶液量很大,可购买带泵的过滤装置 。滤膜的吸附作用力也不容忽视。往往小于滤膜孔径的细菌等亦不能透过。 细菌大小：宽度0.3-1um；长度1-10um 支原体:0.1-0.2um 病毒：0.04um 酵母：2-5um 　紫外灯照射(无菌室、超净台)：波长260nm，距离小于1.2m，15-30min。每周一次. 中国是紫外线杀菌灯的主要生产国之一，主要集中于广东佛山，浙江海宁 * * 熏蒸灭菌(无菌室):100ml/20m2甲醛 + 5g/20m2 高锰酸钾；新的实验室或长期不用的实验室.湿度较大的季节要定期进行. 喷雾消毒(超净台;无菌室)：75%酒精或3%来苏儿 * 第3章 无菌技术 无菌是细胞培养成功的最基本要求 无菌技术是进行离体培养的基础，设备、培养基、悬浮系统和操作方法等的复杂性都易引起微生物污染。 操作人员建立极强的无菌意识和具有良好的无菌操作技能，是细胞工程实验能够成功的必须的也是基本的要求。 一、常用灭菌方法及原理 细胞培养中易引起污染的微生物污染源主要有：细菌、真菌、支原体、病毒等. 杀菌的等级 灭菌：杀死物体上的一切微生物，彻底杀菌 消毒：杀死物体上的有害微生物，使之达到无害化。 防腐：利用化学或物理方法，防止或抑制微生物的生长繁殖。 （一）热力（高温）灭菌 利用高温杀死微生物的方法 高温灭菌的基本原理：当高温作用于微生物时，使细胞内的蛋白质凝固，原生质变性，酶结构破坏或被钝化，新陈代谢活动