细胞化学技术课件.ppt

细胞化学技术; 组织化学技术: 应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物 学的原理和技术与组织学相结合而产生的技术，能在 组织切片定性、定位地显示某种物质的存在与否以及 分布状态。还可进一步用显微分光光度计或图象分析 仪测定光镜切片中该物质反应的强度，获得定量的信 息。 细胞化学技术: 应用组织化学技术于游离细胞的样品(如细胞涂 片)，则称细胞化学技术。; 一 组织细胞化学染色 ; 组织细胞化学染色方法分门别类有许多种,结果的显 示也不尽相同,有时即使是检测同一物质,因采取的方法 不同,其结果有可能存在一定的偏差,另一些是由于方法 学上本身的缺陷,其结果也可能产生误差,所以我们应注 意选择结果稳定、方法简便(操作步骤越繁复,结果出现 误差的可能性就越多),阳性显示明显的细胞化学染色方 法如果条件允许可与细胞免疫化学、细胞遗传学、分子 生物学等相结合,使细胞化学染色发挥最大、最准确的 作用。;常用组织细胞化学染色; 过碘酸一雪夫反应?periodic acid Schiff reaction ,PAS;;; 中性粒细胞碱性磷酸酶neutrophil alkaline phosphatase ,(NAP);;二 组织细胞免疫化学标记技术; 组织细胞免疫标记技术的方法学建立至今仅为短短30年左右的时间，但其发展异常迅速，检测方法可多达20多种以上。其基本原理是将组织和细胞作为抗原，与其相应的特异抗体产生抗原－抗体反应，并借助荧光色素、酶、胶体金、铁蛋白等显示系统，在被测组织和细胞所相应的位置显示出来。由于抗原－抗体系统具有高度的特异性和敏感性，能够将细胞形态学和功能代谢紧密的结合起来，进行观察和分析。; 目前实验室常用的方法有免疫荧光法，PAP法，ABC法、IGSS法等10大类。但由于各种方法均有其特性和检测适应范围，即某一种方法无法在所有的检测标本中被应用，我们应充分发挥各种方法上的特点。有选择性的将不同来源的组织和细胞标本并选用不同的方法来进行检测。使我们的检测结果更精确。;一．免疫荧光细胞化学技术;（一）直接法 是以荧光标记抗体直接与被检标本内的抗原反应。 依据荧光出现的位置及强弱对被检细胞做出判别。该法的 优点为简单特异。但其缺点也很明显即敏感性较低另需制 备大量特异性的荧光抗体。 （二）间接法 间接法采用抗球蛋白试验原理，先制成荧光素标记抗抗 体。检测中先将特异性抗体与被检标本作用一定的时间 后，充分洗去未结合的游离特异性抗体，然后添加荧光素 标记抗抗体使之形成被检抗原－抗体－荧光素标记抗抗体 复合物，由此显示特异荧光并因复合物上带有较多荧光 标志物，所以其敏感性比直接法要高。;;（三）补体法 这是一种间接法的改良。既在抗原抗体反应时加入补 体，然后再与荧光素标记的抗补体抗体结合形成抗原－抗 体－抗补体荧光抗体复合物。此法敏感性较高。但其较易 出现非特异性染色，而且操作过程相对较复杂。 （四）双标记法 运用两种荧光素在不同的激发光下显示不同颜色的特 点，将不同荧光素分别标记所需的特异性抗体。可在同一 标本上测定不同的抗原。此法即可采用直接法也可用间接 法进行。若分别采用兔源性和鼠源性等不同种属的抗体， 甚至可进行三重或多重标记法。;;;MAL 萤光标记 ：黄（CD19 ）红（CD13）;;二、 免疫酶细胞化学技术; 细 胞;（一）??辣根过氧化酶免疫酶标记法;（二）免疫碱性磷酸酶标记法 碱性磷酸酶是一种磷酸酯的水解酶。从大肠杆菌中提取的此酶最适PH为8.0左右。其作用的底物有磷酸萘酚AS－MX和磷酸萘酚AS－BI，显色的偶联剂可采用固红-GBC和固蓝-BB等。免疫碱性磷酸酶染色方法很多，有直接法；间接法；APAAP法；ABC－AP法；但APAAP法和ABC－AP法二种，较为常用，且这二种方法其敏感性和特异性均较满意。;;;三、多聚螯合物法(ELPS);;;;;组织细胞免疫化学操作方法要点;三、复合免疫组织细胞化学染色;(一)PAP和ABC-HRP PAP和ABC-HRP均属免疫酶标记技术，且都带有辣根过氧化酶基 因。将这两种技术连续应用于一张涂片上,可提高检测的敏感性和 微量抗原的检出率。其基本原理先进行PAP技术，再用生物素化二 抗与其结合，最后连接ABC复合物。经过这两次技术可使微弱的原 始信号得到比应用一种技术更大的放大效果。 (二)免疫荧光技术和免疫荧光技术 利用不同荧光素在激发光下呈现不同颜色这一特点,如异硫氰酸 呈黄绿色，异硫氰四甲基罗达明显红色。若将这二种荧光素采用 不同的方法同时标记在同一细胞上，用荧光显微镜换茬时，调节 不同荧光素所需的特定波长的光波，就可以检测不同的抗原成 分。;（三）免疫荧光技术