检定用菌种传代、贮存、接种操作细则.doc

检定用菌种、传代、贮存、接种操作细则 传代与接种操作步骤： 先点燃酒精灯，在火焰旁的上部空间操作，烧灼接种环。 再将菌种管（即原有的菌种斜面培养基）与待接种的新鲜斜面培养基（接种管）持在左手拇指、食指与中指之间，要注意能清楚的观察到斜面，菌种管在前、接种管在后，应斜持试管显45℃角，使试管内斜面上，两试管口平齐，注意不要持成水平，以免底管凝聚小浸湿培养基表面。 用右手将两管棉塞转动，以便接种时易于拔取。再灼烧接种环注意灼烧时，接种环应垂直或稍斜的在外焰上灼烧，外焰温度与内焰高，顶端的环必须烧红，以彻底灭菌，环以上进入试管部分也应充分通过火焰灭菌。 使用右手小指与无名指及无名指中指之间，在火焰旁分别拔下两只试管的棉塞、持住，将试管口通过火焰，以杀灭管口可能沾污的细菌，但勿烧烫。 将灼烧过的接种环伸入菌种管，先接触无军生长的培养基快速冷却，若接触的培养基有熔印时则表明接种环未冷却，能烫死细胞。待冷后，从斜面上挑取菌苔少许，在火焰旁边，迅速踌躇接种环伸入接种管，在管内斜面上划线接种。划线时在斜面上应先由内向外划一直线后，再由内向外划曲线。 *注意事项： 整个操作过程应迅速且在酒精灯上方操作，勿使菌苔沾至管壁或管口。 从菌种管取出少量菌种苔后接种环，切不可通过火焰，以免菌种被烧死，也不宜火焰太远。（避免污染） 接种完毕后，立即在火焰旁塞上棉塞，再将接种环灼烧灭菌放回原处，再把可能未塞紧的棉塞塞紧，即可置适宜温度培养。 操作过程中，若棉塞不慎触及火焰而着火，切忌用口吹，若是棉塞进试管塞内一端着火，可在刚刚着火时迅速塞入试管，因管内氧气不是会很快熄灭，若棉塞外着火，可用手捏熄，若棉烧坏不宜再用，可另取未接种斜面培养基的灭菌棉塞，代替塞上。 借重完毕，应做好记录。 菌种的分离鉴别操作细则 目的：当菌种污染某菌时，可将菌种接种于平板培养基进行分离，再根据菌种形态，挑取典型纯菌落并鉴别制成菌种管。 分离方法及步骤： 取已污染某菌的菌落管，左手拿着菌种管拧松棉塞。 将接种针充分灼烧灭菌（包括种入试管内部一段），同菌种传代操作细则，冷却后，挑取少量菌苔，抽出后，迅速在火焰上方通过菌种等口和棉塞，并塞上将菌种管放回原处。 取备好的无菌平板，用小指和无名指托住平皿，大拇指中、食指揭起平皿一侧，将接种针伸入平民内一侧边缘开始连续划曲线。划曲线大约1/4平皿处，转动平皿90%，并 充分灼烧接种环，冷却后，再做曲线连续划线，使接种处完全覆盖于琼脂表面。注意每次划的曲线只与赏赐所划曲线相交3-4次。 划线完毕后，将平皿置适宜温度培养箱倒置孵育24～48h，取典型形态纯菌落作鉴别，并按传种操作细则作菌种贮存待用。 注意事项： 整个操作过程均应在火焰上方进行，并且动作应熟练迅速。 鉴别试验若需超过24h，则应将平皿置2～8℃冰箱冷藏。 鉴别试验（主要对已知菌种确认） 包括以下试验： 革兰染色镜检、记录阴性或阳性与球菌及杆菌。 菌落形态的外观记录（见P89微生物与检验）。 氢氧化钾拉丝试验（见P104微生物与检验） 金葡萄菌特征： 培养特性：需氧或兼性厌氧菌，最适宜生长温度37℃，最适宜pH7.4，耐酸性强，可用10%-15%氯化钠培养基分离葡萄球菌，在营养肉汤中经37℃，培养24h。当均匀混浊状，管底稍有沉淀生长，摇动易消散。在营养琼脂培养基平板上，产生金黄色脂溶性色素，呈金黄色，不溶于水，菌落较小，直径多在0.8～1.5mm，圆形，凸边，边缘整齐，光滑，湿润，不透明。 革兰镜检特征；为革兰阳性球菌、无芽孢、无荚膜，排列呈不规则的葡萄状，菌体较小，亦可成单个、成双或短链排列。 生化特征：血浆凝固酶试验：取灭菌试管，加入血浆：0.9%无菌氯化钠溶液（1：1）0.5ml。置37℃培养箱3h后开始观察结果，以后每隔适当时间观察一次，直至24h。检查时，轻轻将试管倾斜，仔细观察，血浆凝固者即为阳性。 注意事项： 在固体培养基上分离培养时；培养基最好新鲜配制，培养时间宜稍长，培养基中含有新鲜酵母膏可使色素产生更明显。 革兰染色时应注意： 2.1、待检菌菌龄应为18～24h，特别是革兰阳性菌，培养过久，细菌胞壁溶解导致假阳性。 2.2、涂片时应匀而薄，过于密集的菌体，因脱色不匀呈假阳性。 2.3、脱色时间的控制，是染色中最关键的一步，脱色时间不足，革兰阴性菌可染成阳性菌，脱色过度，革兰阳性菌会染成阴性菌，一般应以无紫色脱出时立即用水洗（并沥干）。 2.4、碘液配制后，应装在密闭的暗色瓶内储存。若储存不当。部分碘将被挥发或被还原，试液由原来红棕色色变成浅黄色，则不宜再用。 2.5、血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新鲜血浆，观察时，不宜摇动试管，因凝固初期凝块不结实易破坏，引起假阳性。