植物基因组DNA提取技术.ppt

实验一 植物基因组DNA的提取 DNA extraction DNA提取原则 保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染 DNA提取的几种方法 CTAB法 SDS法 其它 CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变使酚容易去除。 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 氯仿/异戊醇抽提（氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程 中出现的气泡）。 使用变性剂变性 （SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基 乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二 醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 除盐离子： 70％的乙醇洗涤 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解 实验材料和试剂 实验材料：植物幼嫩叶子。 实验所需试剂： 离心机 微量移液枪的使用一定要规范，吸取氯仿等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中； 提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小片段，所以为保证DNA的完整性，各步操作均应较温和，避免剧烈震荡。 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 2. 吸入1.5mLeppendorf 管中，摇动混匀 实验过程 3. 60℃水浴保温30-60min 实验过程 4. 10000rpm离心5min 实验过程 5. 吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，颠倒混匀 实验过程 6. 10000rpm离心5min； 将上清小心吸入新的离心管中 实验过程 7. 加入1倍体积异丙醇，-20 ℃放置10min，出现絮状DNA沉淀； 随后8000rpm离心5min ，弃掉上清；75％酒精洗沉淀一次晾干沉淀；加5μL RNaseA (10μg/μL), 37℃ 10min, 除去RNA； 加50-100μL的TE Buffer ，取1-5μL电泳检测；其余-20 ℃ 贮存备用。 实验过程 DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳（例图） 高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象 DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 μg/ mL 双链 DNA， A260/280 约为1.8 实验过程 注意事项 材料准备：最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。 液氮研磨：研磨样品时要有液氮的保护，在整个过程中都不要让液氮挥发干净。此外尽量将样品研磨的很细，这样可以提高DNA产量。 细胞裂解：材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。高温温浴时，定时轻柔振荡。 DNA沉淀：用乙醇或异丙醇都可以。异丙醇沉淀的效率要高于无水乙醇，但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀， 且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去 。 DNA干燥：自然晾干DNA，让乙醇充分挥发。 DNA溶解：若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子 有RNA的存留 原因 对 策 重新纯化DNA，过吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次） 加入RNase降解RNA 问题解析 问题二：DNA降解。 材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融 原 因 对 策 尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富