用Trizol提取DNA,RNA及蛋白质的方法及注意事项.doc

TRIZOL试剂 警告：接触皮肤或误吞将导致中毒或灼伤。接触皮肤之后立即用去垢剂和水冲洗。若感到不适，请遵医嘱（可能的话出示标签）。 收到药品后，在室温下存储。以已证明TRIZOL在常温下可稳定储存12个月。 说明： TRIZOL是一种从细胞和组织中提取总RNA的现用试剂。该试剂是一种苯酚异硫氰酸酯单相溶液，它发展自Chomczynski 和 Sacchi的RNA一步抽提法。在细胞破碎和溶解细胞组分时，TRIZOL可以保持细胞匀浆或抽提物中RNA的完整性。离心后加入氯仿，将溶液分为水相和有机相。RNA只留在水相中。转移水相后，用异丙醇沉淀回收RNA。除去水相后，样品中的DNA和蛋白质也可以用后续沉淀方法回收。用乙醇从相界面间沉淀DNA，异丙醇从有机相回收蛋白质。DNA的共纯化可能对样品间RNA产量的正常化有用。 这项提取技术对人、动物、植物或细菌来源的各种量的组织（低至50-100mg，高至≥1g）和细胞（低至5×106，高至＞107）都有良好的效果。其简单的操作方法允许同时处理大量样品。整个过程可在1小时内完成。用TRIZOL提出的总RNA不含蛋白质和DNA污染，可用来做Northern 电泳分析、斑点杂交、poly (A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。在PCR和扩大DNA酶Ⅰ梯度分离中，建议使用一个内含子中的两个引物。 TRIZOL简化了各种类型的大分子及小分子RNA的分离。例如，从鼠肝分离的RNA经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，显示出介于7到15kb的大分子RNA条带,（由mRNA和hnRNA组成的）两个约5kb（28S）和2kb（18S）核糖体RNA的条带，以及介于0.1到0.3kb（tRNA, 5S）的小分子RNA的条带。所分离的RNA稀释于TE时A260/A280之比大于等于1.8。 谨防RNase的污染： 在提取中任何不正确的操作方法中都可能偶然引入RNase。由于其活性难以抑制，因此只能直接避免其引入。在处理RNA时需要注意以下规则。 戴一次性手套。皮肤上往往沾有污染RNA的细菌或霉菌，并成为RNase的来源。训练良好的微生物学操作方法以避免微生物污染。 使用无菌的一次性塑料实验用品和移液枪进行RNA操作，避免公共用具的Rnase交叉污染。例如，用RNA探针的实验室一般会用到RNaseA或T1以降低滤器背景，而任何不能丢弃的实验用品（如移液枪）可能沾有大量的RNaseA。 TRIZOL可以有效防止RnaseA污染。下游样品的处理需要无RnaseA得玻璃或塑料器皿。玻璃器皿应该在150℃下烘烤4小时，塑料制品应用0.5M的NaOH浸泡10分钟，再用水充分冲洗，最后高压灭菌。 其他注意事项： 在装2ml体积的TRIZOL时，建议用透明的一次性聚丙烯管。 用于更大体积时，用玻璃管或聚丙烯管，并试验其能否经受1200gTRIZOL的离心力以及氯仿的腐蚀。不要使用泄露或有裂缝的管子。 离心前小心地称重平衡。 离心前玻璃管需用石蜡膜封闭管口，聚丙烯管必需加盖。 RNA分离技术指南 警告：使用TRIZOL时一定要戴手套和护目镜。避免接触皮肤或衣服。在化学通风橱操作，避免吸入其蒸气。 除特殊情况外，试验操作及试剂存储温度都要求在15-30℃。 需要但无需补充的试剂： 氯仿 异丙醇 75%乙醇（用于焦碳酸二乙酯处理水） 不含RNase水或0.5%SDS溶液（不含RNase水的配制：将水加入不含Rnase玻璃瓶，添加焦碳酸二乙酯至0.01%(v/v)，静置过夜，高压灭菌；SDS溶液的配制要用焦碳酸二乙酯处理的无菌水。） 匀浆化 组织 每50-100mg组织加入1mlTRIZOL在玻璃管中用电力匀浆机匀浆化。取样容积不能超过用于匀浆化的TRIZOL的体积的10%。 单层培养细胞 将1mlTRIZOL加入3.5cm培养皿，用移液枪吹打几次，直接将细胞消化。TRIZOL的加入量取决于培养皿的体积（每10cm2加1ml），而非细胞数。如果加入不足会造成提取RNA被DNA污染。 悬浮培养细胞 离心沉淀细胞。在TRIZOL中反复吹打使细胞消化。每5-10×106个动物、植物或酵母细胞或每1×107个细菌细胞加1ml消化剂。在加入TRIZOL之前先不要洗细胞，因为这会促进RNA的降解。如果需要破碎酵母或细菌细胞就要用到匀浆器。 任选：当处理样品是一些含有大量蛋白、脂肪、多糖和胞外物质的材料如肌肉、脂肪组织、植物的块茎部分等时，还需要添加额外的分离步骤。均一化结束后，在2-8℃下以12000g离心10分钟从匀浆中除去不容部分。该部分含有细胞膜、多糖和大分子DNA，而RNA含在上清液中。脂肪组织样品需要将上层过剩的脂肪收集除去。每次都将清除过得匀浆液转移到新管中，加入氯仿，按前述步骤分离固液相。 2．相分离 将经过匀浆