一免疫印迹法.doc

一。免疫印迹法 免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen blot相类似，亦被称为Western blot。免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。典型的印迹实验包括三个步骤①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。 图1 免疫印迹法原理示意图 第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分 离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。第二阶段为电转移。将在凝胶中已 经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min 转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位。将印 有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶 标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP 底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰 可辨，并可根据SDS时加人的分子量标准，确定各组分的分子量。本法综合了 SDS的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅 广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在艾滋病病毒感染中此 法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体 及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。根据出现显色线条的位置可判 断有无针对病毒的特异性抗体。 二．蛋白质的电泳分离 一、样本的制备 几乎任何蛋白质都可用于免疫印迹。免疫印迹的优势是能分析不能用其他的免疫化学技 术进行研究的蛋白质样品。例如，不能标记的蛋白质或不溶于温和抽提缓冲液的蛋白质等。 免疫印迹还可分析各种组织、器官或微生物等来源的粗制样品。 用于免疫印迹的样本种类繁多，处理的方法也有所不同，为了选择理想的处理方法，应当考虑细胞的类型和待测抗原的性质。 (一)细菌表达蛋白质和样本制备 一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解，具体方法如下： [试剂与设备] （1）表达待检测蛋白质的细菌。 （2）50mmoL／LTris-HCl（pH7.4）。 （3）2xSDS凝胶加样缓冲液： 100mmol／L Tris—HCl（pH6.8） 200mmol／L 二硫苏糖醇（DTT） 4％ SDS（电泳级） 0.2％ 溴酚蓝 20％ 甘油 不含有二硫苏糖醇（DTT）的2XSDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，临用前须从lmol／L二硫苏糖醇储存液现用现加于上述缓冲液中。 （4）台式离心机。 （5）超声破碎仪。 （6）水浴箱。 （7）涡漩振荡器。 （8）加样器与吸头等。 [操作步骤] （1）表达靶蛋白大肠杆菌经诱导适当时间后，用微量离心机以12 000g离心30s，收集lml 培养的菌体。 （2）吸取培养液，加入0.5ml用冰预冷的50mmol／LTris—HCl（pH7.4），振荡沉淀的菌体， 使之复悬，用微量离心机于0°C以12000g离心30s回收菌体。 （3）再次吸出上清液，小心地吸净管壁上的液滴，尽可能使沉淀物不带有残留液体。 （4）加入25μl水，振荡使沉淀复悬，一旦菌体分散开来，立即加入25μl 2XSDS凝胶加样缓冲液，继续振荡20s。 （5）样品在沸水浴中放置5min。 （6）采用带有浸入尖头或能在冷却杯中同时处理多个样品的超声处理仪对DNA进行剪 切，根据所用超声处理仪的输出功率及其设定状态，以最大功率处理0.5—2min应能有效地将裂解液粘度降至可控水平； （7）样品于室温以12000g离心10min，将上清液移至另一管中，弃沉淀物； （8）吸取经剪切或超声处理的样品25μl电泳