分子生物学检验技术-第六章 DNA重组技术.ppt

第六章 DNA重组技术 第 一 节 基因工程相关概念 （三）目的基因 cDNA (complementary DNA) 基因组DNA (genomic DNA) （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 感染（infection） 以λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组 DNA 分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，感染适当的细胞并在细胞内扩增。 转染（transfection） 真核细胞主动摄取或被动导入外源 DNA 片段而获得新的表型的过程。 β- 半乳糖苷酶 乳糖 → 半乳糖 + 葡萄糖 诱导物： 乳糖 IPTG（异丙基-β- D – 硫代半乳糖苷） 底物： X – gal （5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷） 6、其他 酶切电泳 PCR鉴定 测序 （3）E.coli表达体系的缺点 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白 (4)原核表达载体类型： 融合型表达载体：----融合蛋白 非融合型表达载体：---天然完整蛋白 分泌型表达载体：---- 载体SD序列下游有信号肽序列，编码信号肽，可引导蛋白跨膜分泌至胞周间隙。 三、重组技术与医学的关系 4、Southern印迹 目 录 鸡β肌球蛋白的克隆和检出 目 录 5、免疫学方法 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小 结 分 分离目的基因 切 限制酶切割目的基因与载体 接 连接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 目 录 表达体系的建立，包括： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 （六）克隆基因的表达 1. 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用） （1）标准：选择标志；强启动子；翻译调控（ SD）序列；多克隆位点。 （2）优点：方法简单，迅速，经济，适合大规模生产。 大鼠胰岛素原cDNA 的表达和分泌 目 录 5、噬菌体(phage) 双链 DNA 细菌病毒 长度 50 kb 粘性末端（Cohesive-end site） CoS 位点 插入片段较长 18 ～ 22 kb λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列 粘性质粒(cosmid) 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） 6、其他载体 第二节 基因工程原理与步骤 基本原理与步骤 目的基因的获取 DNA导入受体菌 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 目 录 * 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 * 从基因组DNA文库获取目的基因 目 录 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 目 录 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌