流感病毒细胞分离培养.ppt

流感病毒细胞分离培养 一、组织培养概况 （一）组织培养定义 组织或细胞培养是指从机体中取出组织或细胞，模拟机体内的生理条件在体外进行培养，使之生存和生长。 （二）、组织培养的原理 组织培养主要是为病毒易感的组织细胞提供一个良好的生存环境，使细胞对环境产生适应性，获得生长繁殖的能力。 病毒在敏感细胞中繁殖，常可引起细胞代谢等方面的变化，可出现细胞病变并释放病毒到维持液中，这种情况可用细胞病变、色变法及检测维持液中病毒抗原的方法，判定病毒的存在及滴度。 有些病毒不引起细胞病变，有些在核内繁殖不易释放到维持液中，前者可用干扰的方法及免疫荧光的方法来检测病毒，后者常采用冻融破坏细胞获得病毒后检测。 （三）、组织培养所需的材料和条件 1、组织或细胞来源： 人、猴、啮齿类、禽的胚胎、脏器以及昆虫等为组织培养常见的组织来源。用于病毒培养的往往是病毒的自然宿主细胞。如人类病毒用人和猴组织较敏感，但有些病毒用其他宿主细胞亦很敏感，如乙脑病毒对白纹伊蚊细胞系C6/36较人的细胞更为敏感。流感病毒对狗肾传代细胞（Madin darby canine kidney,MDCK）亦很敏感 。 2、单细胞的制备（略） 3．细胞培养的基本条件： （1）细胞接种数：细胞量越大繁殖的速度越快，接种传代细胞一般为10—30万/ml。 （2）合成培养液：如Eagle氏液，RPMI1640，Eagle’s MEM。 不同培养液各有其特点，但往往也适用于各种细胞培养，其主要成分为氨基酸、碳水化合物、维生素、无机盐及其他成分。配制培养液的水一般用单蒸后的去离子水。 合成培养液中不含蛋白质成分，血清蛋白对组织培养是不可缺少的；不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁，不同血清对细胞促进作用不同，以胎牛血清最好，每批血清使用前需以56℃30分钟灭活处理。含有10%血清的培养液能促进细胞增殖，称为生长液。 （3）酸碱度：细胞生长最适宜的PH范围是7.0–7.4。培养环境偏酸较偏碱更宜于细胞贴壁。PH的变化主要取决于，HCO3-浓度、二氧化碳分压，细胞糖代谢能力。使用二氧化碳培养箱，能提供稳定的5%二氧化碳。可自动调节细胞代谢引起的PH改变。 （4）温度：细胞培养的最适温度与细胞来源的动物体温一致，温度增加2–3℃对细胞产生不良影响，使之在24h内死亡。低温对细胞影响较小。 （5）无菌条件：细胞培养的关键之一是要有无菌概念，要防止污染。在细胞培养中，可能发生污染的来源很多，有组织培养液、器皿、组织本身、工作者本身、空气等。因此要对培养液、器皿用具、操作室进行彻底消毒，在操作时要严格实行无菌操作。 （6） 培养器皿的处理：培养器皿处理的好坏与否对于细胞的贴壁生长影响很大。常用的器皿主要有玻璃及塑料二大类。玻璃器皿一般须用清洁液浸泡过夜、清水洗10次后再用蒸馏水洗2次，烤干备用。塑料板一般用2%NaOH浸泡1小时后，清水洗净再用1N HCl浸泡1小时，用清水洗后再用蒸馏水漂洗。37℃干燥后，紫外线照射消毒。 (四）组织培养的优缺点及应用范围： 优点：可提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，对疫苗生产来说，其抗原性更接近于自然流行株，可减少宿主蛋白成分，减少变态反应。 缺点：病毒复制后滴度低，不易保存，保存时易使病毒滴度丢失，传代细胞含致癌因子，不宜用于疫苗生产。且随着细胞代数增加，对病毒敏感性也随之下降。 应用范围：目前组织培养技术已应用于病毒学的各个部门，不仅应用于病毒性疾病的诊断及疫苗制备，也深入应用到病毒学基础理论的研究 二、组织培养分离流感病毒 流感监测最主要的目的是及时发现并分离到有意义的流感病毒新变种，尤其大流行株，用于诊断试剂的制备、疫苗的生产及疫情预报。组织培养技术是分离，诊断流感病毒最常用和最可靠的方法之一。 人流感病毒最初是通过雪貂分离出，但雪貂繁殖慢，量少，价钱昂贵并难饲养，故无法加以广泛应用。上世纪30年代中开始，多用鸡胚来分离流感病毒。 （一）MDCK细胞分离流感病毒 1、实验材料： MDCK细胞（最好是早代的） Eagle氏培养液（日本产的含谷氨酰胺的以抽滤为好） Hank氏溶液 0.25%胰酶和Versene消化液 双抗(青、链霉素)或庆大霉素和抗真菌素 胎牛或小牛血清 5.6%或7.5%的NaHCO3. （1）细胞生长液配制 90ml Eagle’s液+含终浓度为100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素+10ml小牛血清+2ml 5.6%NaHCO3 PH调至 7.2-7.4。 （2）细胞维持液配制: 同生长液，但不含胎牛或小牛血清，而含终浓度为