蛋白质和酶.ppt

2.2.2.5.凝胶过滤gel filtration法测定相对分子量 凝胶过滤可把蛋白质混合物按分子的大小进行分离。该方法简便，仪器虽简单但能相当精确地测出蛋白质的相对分子质量。 2.2.2.6.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子质量 1967年Shapiro等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide）时加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecylsulfate, SDS）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率（electrophoretic mobility）主要取决于相对分子质量，而与原来分子所带的电荷和分子形状无关。 2.2.2.7.蛋白质分子的形状 X射线晶体结构分析是测定蛋白质分子形状或构象的精确方法，但它只能给出晶体蛋白质的立体结构信息。蛋白质在溶液中的结构，只能靠间接方法描述分子形状。 当蛋白质的摩擦比大于1时，蛋白质分子不对称或水化的，或兼而有之。摩擦比（frictional ratio）比越大，蛋白质分子不对称性越高。 2.2.3.蛋白质的分离纯化 ⑴.前处理pretreatment 蛋白质从组织或细胞中以溶解的状态释放，并保持的天然状态和生物活性的过程。 动物：电动捣碎机、匀浆器、超声波破碎组织和细胞，然后离心。 植物：组织和细胞含纤维素、半纤维素和果胶等组成的细胞壁，用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨，或用纤维素酶处理。 细菌：细胞壁骨架是借共价键形成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧，常用超声波飘荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）等。 ⑵.粗分级分离rough fractionation 对蛋白质提取液，用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离等与其他物质分开。方法简便、处理量大，既除去大量杂质，又浓缩蛋白质溶液。 ⑶.细分级分离fine fractionation 对样品的进一步纯化一般使用凝胶层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等，最后的分离纯化可用区带电泳、等电聚焦等方法。 蛋白质纯度越高，溶液浓度越大，越容易结晶，这是最后的分离步骤。得到过饱和溶液，常常控温、盐析、加有机溶剂或调节pH。 2.2.3.2.根据分子大小不同的纯化方法 ⑴.透析和超过滤dialysis and ultrafiltration 透析：利用蛋白质分子不能通过半透膜，使蛋白质和其他小分子物质分开的方法。 半透膜：玻璃纸（cellophane paper，或称赛璐玢纸）、火棉纸（celloidin paper，又称赛璐碇纸）和其他改型的纤维素材料。 超过滤（切向流过滤tangential flow filtration，也称交叉流过滤cross-flow filtration），透析时对半透膜加压，一般液体与膜表面相切的方向流动，使部分液体透过膜，另一部分液体切向流过膜表面，将膜截留的蛋白质分子冲走（反流回样品槽），避免在滤膜表面堆积塞。样品含量低时因吸附不能回收而采用此法。 ⑵.密度梯度（区带）离心density gradient (zone) centrifugation 蛋白质颗粒在有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降快，到与自身密度相等的介质密度梯度即停止，最后各种蛋白质在离心管（常用塑料管）中被分离成各自独立的区带，在管底小孔分部收集。 常用蔗糖梯度，聚蔗糖梯度和其他合成材料。 蔗糖便宜，纯度高，浓溶液（60％，W/W）密度可达1.28g/cm3。 聚蔗糖的商品名是Ficoll，由蔗糖和1-氯-2,3-环氧丙烷合成的高聚物，Mr约400,000，需高密度和低渗透压的梯度时，可用Ficoll代替蔗糖。 ⑶.凝胶过滤gel filtration 又称凝胶过滤层析、分子排阻（molecular-exclusion）层析、凝胶渗透（gel permeation）层析。这是按大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。 常用的凝胶有交联葡聚糖，聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖等。交联葡聚糖是由线形的α-1,6-葡聚糖与1-氯-2,3-环氧丙烷反应而成的化合物，商品名称为Sephadex。聚丙烯酰胺凝胶（商品名称为Bio-gel P）是一种人工合成的凝胶，它是由单体丙烯酰胺（acrylamide）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylenebisacrylamide）共聚而成的。琼脂糖是从琼脂中分离制得的，商品名称微为Sepharose或Bio-Gel A