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烟草总RNA提取 一、实验前方法及试剂的选择 1.提取RNA 的目的决定方法 RNA 用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残留；Northern 对RNA 完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。投入决定产出；每次都以获得最高纯度的 RNA 为目的，。 2.样品的收集/保存影响降解的因素 样品离开活体/或者原来的生长环境后，样品中的内源酶即会开始降解 RNA，降解速度与内源酶含量及温度有关。传统上，只有两个办法可以彻底抑制内源酶活性：立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆；切成小块后立即投入液氮冷冻。这两个办法都要求操作快速。后者适合所有的样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织。具体地讲，植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来，再往下做。  3.样品的破碎及匀浆影响降解和得率的因素  样品的破碎是为了彻底匀浆，匀浆是为了使 RNA 彻底完整地释放出来。细胞无须破碎即可直接匀浆，组织需要破碎后才能匀浆，酵母菌和细菌需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。内源酶含量较低并且较容易匀浆的组织可以在裂解液中通过匀浆器一次完成破碎和匀浆过程；植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等样品，它们不是内源酶含量高，就是不容易匀浆，所以必须将组织的破碎和匀浆分开操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的匀浆方法是使用电动匀浆器。使用液氮碾磨要特别注意一点：在整个碾磨过程中，样品不得融化，因为冷冻后内源酶更容易起作用。  .裂解液的选择影响操作方便程度，内源杂质残留的因素  常用的裂解液几乎都能抑制Rnase活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。只有一个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源酶的能力。  5.纯化方法的选择影响内源杂质残留，抽提速度的因素  对于干净的样品，如细胞，手边的几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。但对于许多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯化方法是至关重要的。柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长。 二、提取前准备工作 DEPC处理水的配制 DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩DEPC气味芳香浓烈，强挥发性，有毒，需在通风橱中操作不小心占到手上注意立即冲洗RNase AwayTM试剂可以替代DEPC，操作简单，价格低，且无毒性。只需将RNase AwayTM直接倒在玻璃器皿和塑料器皿的表面，浸泡后用水冲洗去除，即可以快速去除器皿表面的RNase，并且不会残留而干扰后继实验。 (1) 配制DEPC水溶液(用来浸泡枪头、离心管等)：1000mL灭菌去离子水中加入1mL DEPC，盖紧塞子振摇5min，静置4小时，倒入盛有枪头和离心管的容器内，用保鲜膜封住容器口以防止DEPC挥发，室温静置过夜，倒掉溶液，处理物品灭菌30min以除去残留的DEPC。 倒出的DEPC水溶液高压灭菌30min再丢弃。枪头、离心管(2) 配制 DEPC处理水（用来配RNA电泳用缓冲液）：1000mL去离子水中加入1mL DEPC，盖紧塞子振摇，静置过夜，再加上塑料袋封紧瓶口，高压灭菌30min以除去残留的DEPC。(3)配1000ml的DEPC处理水，加1ml DEPC。在搅拌器上搅拌处理至完全溶解，即看不到油珠为止高压蒸汽灭菌DEPC分解成二氧化碳和酒精，封闭冷藏备用。最好分装小瓶，尽量避免污染。 三、方法 1.1 RNA提取（RNeasy Plant Mini Kit提取）在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提取缓冲液中裂解植物组织粉末。在提取缓冲液中包含RNase酶抑制剂，抑制RNase活性并确保RNA的完整性。通过第一次离心柱时细胞碎片阻留在柱上，溶液被均质化，包括RNA在内的小分子物质通过离心柱，加入乙醇后，再经过第二个离心柱，RNA就结合在底部有硅胶的膜上，洗去其他杂质，最后用无RNase水溶出RNA，该柱子最大可结合100 μg大于200 bp的RNA，小分子RNA如5.8S、5S、tRNA将会丢失。每个柱子所用起始材料最多为100 mg，可分离30~70 μg的总RNA。由于不同发育阶段