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第七章高效毛细管电泳
第七章高效毛细管电泳 7.1 概 述 分离生物高聚物最有效和最广泛应用的三大方法 : 经典电泳技术、离心法、色谱法 三种方法各有优缺点 色谱法:气相色谱法(GC)虽然分离效率、选择性、灵敏度都很高,但是它只适用于热稳定性好、易挥发的物质。高效液相色谱法(HPLC) 不受热稳定性及挥发性的限制,可以分析热稳定性差、难挥发的物质,但是和GC相比,缺乏灵敏的通用型检测器,实验中需消耗大量的有机溶剂,对于大分子物质因其分子扩散系数小、传质阻力大,使柱效率大大降低,以至于难以分离分子量大于2000的物质 经典电泳技术:操作繁琐、费时、定量困难,也很难满足现代生命科学研究的要求 本世纪80年代初诞生的高效毛细管电泳是将色谱理论和电泳技术相结合的产物 一、高效毛细管电泳的发展史 二、高效毛细管电泳的特点 高效毛细管电泳(HPCE)是指溶质以电场为推动力,在毛细管中按淌度差别而实现的高效、快速分离的新型电泳技术 HPCE的突出特点是 : ①仪器简单,操作方便,容易实现自动化 简易的高效毛细管电泳仪器组成极其简单,只要有一个高压电源、一根毛细管、一个检测器和两个缓冲溶液瓶,就能进行高效毛细管电泳实验 ②分离效率高,分析速度快 由于毛细管能抑制溶液对流.并具有良好的散热性,允许在很高的电场下(可达400v/cm以上)进行电泳,因此可在很短时间内完成高效分离。例如可以在3.1min内分离36种无机及有机阴离子。把碱金属和镧系元素的24种阳离子完全分离仅需4.1min,分离效率可达l05~107块/m ③操作模式多,容易开发新的分析方法 只要更换毛细管内填充溶液的种类、浓度、酸度或添加剂等,就可以用同一台仪器实现多种分离模式 ④实验成本低,消耗少 因为进样为纳升级或纳克级,分离在水介质中进行,消耗的大多是价格较低的无机盐类;毛细管长度仅50~70cm,内径20~75μm,容积仅几微升 ⑤应用范围极广 由于HPCE具有高效、快速、样品用量少等特点,所以广泛用于分子生物学、医学、药学、材料学以及化工、环保、食品、饮料等各个领域,从无机小分子到生物大分子,从带电物质到中性物质都可以用HPCE进行分离分析 三、毛细管电泳的主要模式 1毛细管区带电泳 毛细管区带电泳(简称CZE)是指溶质在毛细管内的背景电解质溶液中以不同速度迁移而形成一个一个独立的溶质带的电泳模式,其分离基础是淌度的差别 毛细管区带电泳的突出特点是简单。但是因为中性物质的淌度差为零,所以不能分离中性物质。CZE模式是HPCE中最简单、应用最广的一种操作模式,是其他操作模式的基础 2胶束电动色谱 胶束电动色谱(简称MECC或MEKC)是1984年日本京都大学寺部茂创立的一种HPCE模式。这种模式把电泳与色谱相结合,其突出特点是将只能分离离子型化合物的电泳变成不仅可分离离子型化合物,而且也能分离中性化合物。从而大大拓宽了电泳的应用范围 MEKC的实验操作与CZE相同,唯一差别是在操作缓冲溶液中加入大于临界胶束浓度的表面活性剂 3毛细管凝胶电泳 毛细管凝胶电泳(简称GCE)是毛细管内填充凝胶或其他筛分介质,如交联或非交联的聚丙烯酰胺。电荷/质量之比相等但分子的大小不同的分子,在电场力的推动下经凝胶聚合物构成的网状介质中电泳,其运动受到网状结构的阻碍。大小不同的分子经过网状结构时受到的阻力不同,大分子受到的阻力大,在毛细管中迁移的速度慢;小分子受到的阻力小,在毛细管中迁移的速度快,从而使它们得以分离 4毛细管等电聚焦 毛细管等电聚焦(简称CIEF)是一种根据等电点差别分离生物大分子的电泳技术,等电聚焦电泳在毛细管中进行,就是毛细管等电聚焦(简称CIEF)。两性物质以电中性状态存在时的pH值叫等电点,用pI表示。如氢基酸、蛋白质、多肽等在其等电点时为电中性,淌度为零,溶解度最小。当所处环境的pH值大于其等电点时,两性物质以带负电形式存在;当所处环境的pH值小于其等电点时,两性物质以带正电形式存在。利用两性物质等电点时呈电中性、淌度等于零的特性,建立了等电聚焦电泳 “聚焦”是指当两性物质在毛细管中形成pH梯度时,不同等电点的溶质在外电场的作用下,分别向其等电点的pH范围迁移,该过程叫聚焦。 当溶质迁移到等于其等电点的pH范围时,就不再移动,形成一个很窄的溶质带。由于不同两性电解质的等电点不同,聚焦的pH范围不同,可以形成一个个独立的溶质带而彼此分开 5毛细管等速电泳 等速电泳(CITP)是70年代发展起来的一种电泳技术。用毛细管进行等速电泳,就是毛细管等速电泳(CITP)。用两种淌度差别大的缓冲体系分别构成前导离子和尾随离子,将试样像夹心饼干一样夹在两者之间.在一次电泳中可以同时分离正离子或负离子 以分离阴离子为例:一般前导电解质
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