第五章基因克隆技术.doc

第五章　基因克隆技术 基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。 基因克隆的一般程序为： 一、获取目的基因 目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。 2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。 3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。 4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。 二、选择适当的载体 按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。理想的载体应该是：(1)分子量较小，能在细胞内自主复制的环状或线状DNA分子；(2)具有特异的限制性酶切位点，便于外源DNA片段的插入，且有明显的遗传筛选标志，如抗药性或插入失活等，以利于阳性克隆的筛选；(4)具有生物安全性。常用的克隆载体可分为三类，即质粒、噬菌体及病毒。由于天然载体用于基因克隆存在许多缺点，现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。 1、质粒载体 质粒是细菌染色体外小型环状DNA复制子，质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒载体具有如下特点：分子相对较小(3~10kb)；含松弛型复制子因而在宿主细胞的拷贝数高；在复制子外适当位置有由多个单一内切酶位点组成的多克隆区，极有利于外源DNA片段的插入；具有抗药性及插入失活标记，可以从平板中直接筛选阳性重组子。但由于质粒分子太小，只能接受小于15kb的外源DNA片段的插入。因此，插入片段过大，会导致重组子扩增速度减慢甚至插入片段丢失。 2、噬菌体载体 目前使用的噬菌体载体主要有λ噬菌体、Cosmid及M13噬菌体等。λ噬菌体是一种能感染大肠杆菌的病毒，其基因组为线状双链DNA分子。在λ噬菌体DNA(λDNA)的中间1/3处，是可被替换而不影响噬菌体生长的“非生活区”，此区的DNA可通过遗传工程技术由外来DNA片段所替代。λDNA作为载体的优点是：在体外可包装成病毒颗粒高效地感染大肠杆菌；载体容量大，可将23~25kb的外源DNA片段引入其内；筛选和保存较为方便。 M13也是大肠杆菌噬菌体，其基因组为单链线性DNA分子。感染大肠杆菌后，此单链DNA转变为复制型双链DNA。克隆复制后，仍以单链形式包装成新的噬菌体释放到介质中。M13DNA分子中有一长507个核苷酸的小“非生活区”可以被外来DNA片段取代。M13载体的主要优点是重组的M13DNA仍为单链结构，所以能方便地用于Sanger双脱氧法测定所克隆DNA片段的序列，或用于合成RNA探针的模板。M13载体的主要问题是容量太小，当插入片段大于1000个核苷酸时就很不稳定，容易在增殖的过程中丢失。 Cosmid载体从结构上看成是一种人工构建的杂种载体，由噬菌体DNA和质粒DNA的某些功能片段拼接而成，其转染细胞及病毒颗粒包装与λDNA相似，但在细胞内的复制则与质粒相同。与λDNA相比，Cosmid的主要优点是载体容量很大，