分子生物学在外科中的应用.doc

分子生物学在外科中的应用 分子生物学在外科中的应用 第一节概述 分子生物学用物理学、化学、生物学和免疫学等学科的理论和方法，从分子水平研究生物大分子的结构和功能，并通过基因和生长因子的变异来研究疾病如肿瘤、遗传病、心血管疾病、感染和免疫等发生和发展的本质，为它们的诊断和治疗提供新的理论和技术基础。分子生物学研究的不断深入和分子生物学技术的广泛应用使外科医生能够从分子水平对外科疾病如肿瘤、器官移植、感染、创伤以及先天畸形等进行研究，从而使外科疾病的诊断和治疗产生质的飞跃，同时基于分子生物学理论和基因工程技术发展起来的干细胞研究、组织工程、生物材料以及生物制药等新兴领域也在外科学领域得到广泛应用。 第二节分子生物学与外科疾病诊断 外科疾病中一个很重要的内容就是肿瘤，而肿瘤生物学又是细胞分子生物学里发展最为迅速的领域。随着肿瘤分子生物学的迅速发展，可以检测肿瘤相关基因的存在、分析肿瘤相关基因的缺陷及表达功能，及其与瘤细胞分化、转移之间的关系，以达到通过基因早期诊断肿瘤并判断预后的目的。 一、肿瘤相关基因 (一)癌基因细胞基因组中能够使正常细胞发生恶性转化的基因称为癌基因(oncogene)。在绝大部分的情况下，这类潜在的基因处于不表达状态，或其表达水平不足以引起细胞的恶性转化，或野生型蛋白的表达不具有恶性转化作用，称为原癌基因(proto– oncogene)。正常情况下原癌基因的表达受到严密的调控，当这些基因发生变异时可持续异常表达，其产物可使细胞持续增殖。根据其产物作用可分为：生长因子、生长因子受体、蛋白激酶、ras基因产物及核转录蛋白等，常见原癌基因有ras、myc、erbB等。 (二)抑癌基因抑癌基因(antioncogene)是一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因。当它失活时，可能使癌基因充分发挥作用从而导致癌的发生和发展。常见抑癌基因有p53、p16、nm23、APC、Rb等。 (三)肿瘤耐药相关基因肿瘤细胞在受到抗肿瘤药物的作用之后，甚至在抗肿瘤药物作用之前，产生了针对这种药物或相关药物，甚至是无关药物的抗药性，称为多药耐药性(multi drug resistance MDR)。肿瘤多药耐药性主要与MDR-1基因表达的P-糖蛋白及MDR-相关蛋白相关。 二、分子生物学与肿瘤诊断 (一)肿瘤分子生物学诊断策略 以DNA和RNA为诊断材料，应用分子生物学技术，通过检查基因的结构或表型来诊断疾病的方法称为基因诊断。 1.染色体异常的检测某些原癌基因在原位染色体时无致癌活性，当它易位到其他染色体时则表现为致癌活性。原位杂交技术或原位PCR技术结合染色体显带技术可进行癌基因的染色体定位以及特定顺序的断裂点检测等。 2.基因突变检测基因突变是原癌基因激活的最为常见的方式之一，对于基因突变的分析可应用单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、核酸分子杂交以及最近发展的DNA芯片杂交技术等。 3.基因扩增检测一般癌基因多为单拷贝基因，但在癌细胞中拷贝数常大量增加即癌基因扩增。可以用限制性内切酶对基因DNA进行酶切，然后通过Southern印迹杂交分析该基因拷贝数的变化。 4.肿瘤相关病毒基因检测由于病毒小且难以培养，一般方法检测效果较差，而PCR和核酸杂交技术检测病毒则有较高的特异性和敏感性。 5.肿瘤表达的检测肿瘤基因的扩增可表现为转录产物mRNA的增加，可通过逆转录PCR、Northern blot等技术来检测。近来发展的免疫组织化学、免疫印迹法、流式细胞仪、蛋白芯片等技术可检测肿瘤组织或血清中异常的癌基因蛋白,有着较为广阔的临床应用前景。 6.端粒酶检测人体正常细胞的端粒酶失活，因而端粒不断缩短，最后细胞发生凋亡。而恶性肿瘤细胞中端粒酶活化，使染色体端粒稳定的维持在一定长度，从而使癌细胞持续增殖获得永生化。端粒酶活化在恶性肿瘤中阳性率为85%~95%。TRAP法(telomeric repeat amplification protocol)可在104个细胞中检测到一个永生化细胞的端粒酶活性，具有敏感性强、特异度高的特点。 7.微卫星不稳定性分析人类基因组的基因内或旁侧序列中存在许多1~4bp的串联微小重复序列，称为微卫星DNA。重复序列的增加或丢失称作微卫星不稳定性，在多种肿瘤基因组尤其是有DNA错配修复系统缺陷的肿瘤基因组中可检测到微卫星不稳定性。其基本技术为通过微卫星DNA两侧的DNA序列设计PCR引物，通过凝胶电泳来分析PCR产物。 (二)基因诊断在临床中的应用 1.肿瘤易感性检测肿瘤遗传学研究发现，部分恶性肿瘤的发生有其遗传学基础