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Western Blotting 虞峰 09.6.5 一、试剂配制 1.基础试剂 10% SDS 10g SDS加双蒸水溶解，定容至100mL，室温保存 1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8） 12.12g Tris，用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水至100mL，灭菌后4℃保存 1.0mol/L Tris-HCl（pH7.5） 12.12g Tris，加双蒸水至80-90mL, 用浓HCl调pH至7.5，加双蒸水至100mL，灭菌后4℃保存 1.5mol/L Tris-HCl (pH8.8) 18.16g Tris, 加双蒸水至80-90mL，用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水水至100mL，灭菌后4℃保存 0.25mol/L EDTA(pH8.0) 9.31g EDTA，加80-90mL双蒸水溶解，,用固体NaOH调pH至8.0 ，定容至100mL 30%Acr-Bis mixture 29g Accylamide, 1g Bis-acrtamide, 加双蒸水溶解，定容至100mL，4℃避光冷藏 10%AP 0.6g过硫酸铵，加双蒸水溶解，定容至6mL，分装160μL/管，-20℃冷冻保存 2. Buffers Lysis buffer 1mol/L Tris HCl(pH7.5) 5mL (50mmol/L) 0.1mol/L EDTA 5mL (5mmol/L) TritonX-100 1mL (1% V/V) NaCl 0.8775g Add DD water Up to 100mL 6X Loading Buffer配法： 不含DTT的Loading Buffer Tirs HCl(pH8.0) 25mL 甘油 100mL 10%SDS 80mL 溴酚蓝 0.080g 取10mL不含DTT的Loading Buffer,加入0.540gDTT，溶解后分装，保存在-20℃ 10X Running Buffer Tris 36.2g 甘氨酸 144g SDS 10g 加双蒸水至1L 10X TBS Tris 24.2g NaCl 80g 加双蒸水至1L TBST 10x TBS 100mL Tween-20 1mL 加双蒸水至900mL，调pH=7.4, 加双蒸水定容至1L 1X Trans Buffer（半干转膜用） Tris-base 5.82g 甘氨酸Glycine 2.93g SDS 0.375g 甲醇 200mL 加双蒸水至1L 也可配制时不加甲醇,临用时再添加. 如果配制的是含有甲醇的溶液，必须用密封容器盛装，以免甲醇挥发 10X Trans Buffer （湿法转膜用） 甘氨酸144g Tris 33.3g 加双蒸水定容至1L 1X Trans Buffer （湿法转膜用） 用双蒸水把10X的Trans Buffer （湿法转膜用）稀释到1X的浓度。置于0度或4度冰箱备用。 3. Gels 分离胶 10mL 6% 8% 8% 10% 12% H2O 5.3 3.45 4.6 4.0 3.3 30% Acr-Bis 2.0 1.95 2.7 3.3 4.0 1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) 2.5 1.95 2.5 2.5 2.5 10% SDS 0.1 0.075 0.1 0.1 0.1 10% 过硫酸铵 0.1 0.075 0.1 0.1 0.1 TEMED 0.008 0.0045 0.006 0.006 0.006 浓缩胶 3mL 5% H2O 2.1 30% Acr Bis mix 0.5 1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8） 0.38 10% SDS 0.03 10% 过硫酸铵 0.03 TEMED 0.003 *****以上单位都是mL***** 可分离的目标蛋白分子量(kD)范围