Western blot ,帮你理解幻灯片.ppt

（1） 转一张膜需准备 6 张7.0～8.3cm 的滤纸和1 张7.3～8.6cm 的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h 才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。 若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。 （2 ） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和 浸过的膜。 （3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以 擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫 三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去 其中的气泡。 （4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。 撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。） 除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。 小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。 将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖 3 张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。） （5） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。 转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用 60V 转移2 h 或40V 转移 3 h。 1．封闭： 将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。 2．结合一抗： 一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。 反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。 3．洗涤： 一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。 4．结合二抗： 根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。 5．洗涤： 二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。 封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200ml PBST 六） 化学发光，显影，定影 （1） 将A 和 B 两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min 后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min 后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入 X- 光片夹中。 （2 ） 在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片,用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大 1cm）；打开X-光片夹，把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号 的强弱适当调整曝光时间，一般为1min 或5min，也可选择不同时间多次压片， 以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为 1～2min （20～25 ℃），温度过低时（低于 16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为 5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲残留的定影液后，室温下晾干。 应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。 Western Blot 间接法基本原理：首先利用SDS对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如5%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除