血红蛋白的提取与分离上课课件.ppt

初次离心后的结果 装配好的凝胶柱 本课题学习目标 * * 血红蛋白的提取与分离 1.分离生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 2.蛋白质分离和提取的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 基础知识 基础知识（一） 凝胶色谱法（分配色谱法） 凝胶： 大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或 琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。 根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。 1.概念： 2.凝胶色谱法的原理 ①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。 3.凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程 （二）缓冲溶液 1.概念及作用: 在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。 2.类型：⑴弱酸和强碱盐 H2CO3-NaHCO3 CH3COOH-CH3COONa ⑵弱碱-强酸盐组合：NH4OH-NH4Cl ⑶多元弱酸的酸式盐和它对应的次级盐组合 NaH2PO4-Na2HPO4 KH2PO4-K2HPO4 3.缓冲溶液的配制: 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。 4.在本课题中使用的缓冲液是:__________ , 其目的是: 磷酸缓冲液 利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性) （三） 电泳： 1.概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 3.类型: 琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。 聚丙稀酰胺凝胶电泳 1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决 于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入 SDS。 2.原理： 聚丙稀酰胺凝胶电泳 SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 3. SDS作用机理: 血液 血浆 水 分 其他物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等 血细 胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （90％） 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁红素基团 2. 血液有哪些成分？ 1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。 血红蛋白 血红蛋白 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁红素基团 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团， 此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳，血红蛋白因含有血红素而 呈红色。 血红蛋白的特点： 二、实验操作 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 1.样品处理： （一）蛋白质提取和分离步骤 （二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。 (1)红细胞的洗涤: ①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化，洗涤次数不可过少。 ②洗涤操作： 1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越