Y染色体微缺失检测试剂盒颜色补偿实验操作说明书.doc

Y染色体微缺失检测试剂盒颜色补偿实验操作说明 （适用于Roche Lightcycler 480机型） 【反应液配制】 如下表所示，按照管号1-5分别配制5份不同的反应液，每份反应液配6个平行管。 每个反应管含有22.8 μL的反应预混液，0.2 μL Taq酶（管号6）以及2 μL阳性对照品（管号7）。如反应于96孔板中进行，请按下图所示进行反应液的板位分布排列。 （注：平行管反应液应统一配置后，再分装为6管，每管25 μL） 反应液 内容物 反应板位 反应液1 空白预混液（管号1）+Taq酶+阳性对照 B2-G2 反应液2 FAM预混液（管号2）+Taq酶+阳性对照 B4-G4 反应液3 HEX预混液（管号3）+Taq酶+阳性对照 B6-G6 反应液4 ROX预混液（管号4）+Taq酶+阳性对照 B8-G8 反应液5 CY5预混液（管号5）+Taq酶+阳性对照 B10-G10 【软件设置】 打开主界面，在右侧工具栏中选择“open tools”。打开后，在页面中选择“Detection Formats”，新建一个程序，并命名，如“YDEL”，然后在“Filter Cominarion Selection”中设置所需要的荧光通道波长，并保存，如下图所示： 2、回到主界面，在右侧工具栏中选择“New Experiment”，新建一个实验，在“Detection Formats”菜单中，选择上一步所设检测模式，如“YDEL”；然后，点击右侧“Cutomize”，如下图所示： 3、点击“Cutomize”后，打开以下界面，选择“Dynamic”，确认4个荧光通道全部打“√”，并保存，如下图： 4、将配制好的样本按要求放入第2、4、6、8、10排，分别对应不同的荧光通道，如下图所示： 5、放置样本后，进行实验程序设置，如下表和图所示： 体系 总体积为 25 微升（μl） 分析模式 核酸扩增 反应 阶段 条件 循环数 预变性 95℃； 3分钟（min） 1 PCR 95℃； 15秒（sec） 40 Quantification 61℃； 20秒（sec）采集 72℃； 20秒（sec） 熔解曲线分析 变性 95℃； 1秒（sec） 1 复性 40℃； 30秒（sec） 1 熔解曲线分析 40℃ 升温至66℃； 升温速率 0.03℃/秒； 荧光采集次数5 次/秒。 1 Color Compensation 仪器冷却 50℃； 30秒（sec） 1 6、保存程序后，点击“Start Run”开始运行程序，并保存文件名。 7、在运行界面左侧，选择“Subset Editor”，点击下方“＋”号，新建一个子集，命名为“color compensation”，如下图选择进行颜色补偿实验的反应孔后点击“Apply”。 8、在运行界面左侧，选择“Sample Editor”，在“Select Workflow”中选择“Color Comp”，如下图所示；选择相同反应液的6个平行管，并在“Dominant Channel”中，选择与相应的反应管相对应的荧光通道的波长。 第2排: Water；第4排: FAM 465-510; 第6排: HEX 533-580; 第8排: ROX 533-610; 第10排: Cy5 618-660。 9、程序运行结束后，点击界面左侧“Analysis”，选择“Abs Quant/2nd Derivative Max”，进入界面后，点击“Filter Comb”分别查看四个荧光通道的扩增情况，均应有扩增。如下图所示： 8、点击界面左侧“Analysis”，选择“Color Compensation”，在Subset选项中下拉选项框，选择“color compensation”；进入界面后，选中进行颜色补偿实验的通道，点击“Calculate”；然后，点击右下角“Save CC Object”，将文件保存在“Special Date”文件夹下的“CCC”文件夹中，如文件“YDEL Color Compensation”。具体操作如下图所示： 【颜色补偿的使用方法】 在进行Y染色体微缺失检测实验时，运行程序结束后，点击界面左侧“Analysis”，选择“Abs Quant/2nd Derivative Max”。进入界面后，点击下方“Color Comp（off）”下拉选项框，选择“In Database”，在路径中选择已保存的颜色补偿文件，如“YDEL Color Compensation(CC)”；跳出选项框“Color Compensation Channels”，在所有选项前面打“√”，并确