分子生物学实验复习答案.doc

实验一：DNA的制备 为什么分子生物学实验时需要注意EB污染？ 答：溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配强诱变剂，具有高致癌性由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。 　1.增加样品密度以保证RNA或DNA沉入加样孔内;2.使样品带有颜色便于简化上样过程;3.其中的染料在电场中可以预测的泳动速度向阳极迁移，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小抽提取出蛋白质的污染洗去一些盐离子和CTAB沉淀DNA1.2%琼脂糖凝胶电泳。在紫外检测仪下观察，完整的总RNA样品应呈现三条带：28S、18S、和5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应该为18SrRNA条带的1.5~2倍。反之，说明部分28S rRNA已经降解成18S rRNA。若无清晰条带，则说明样品RNA已严重降解。若加样孔内或孔附近有荧光区带，则说明有DNA污染。 质量鉴定：检测RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是2.2的）。当R1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。送进受体细胞中去进行繁殖和表达是重组DNA技术中重要的工具。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。1、环状DNA分子能够自我复制，或整合到染色体上，随染色体复制。2、有多个限制酶切点(便于切割)3、有标记基因(便于进行检验) 用于转化的质粒DNA应主要是共价闭环DNA。是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。这现象首先发现于细菌，也是细菌间遗传物质转移的多种形式中最早发现的一种，它不同于通过噬菌体感染传递遗传物质的转导以及通过细菌细胞的接触而转移DNA的细菌接合转化(transformation)指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。是裸 DNA 本身，不是通过其他媒介（如病毒）转移到原核生物里面。转染 （transfection）重组导入受体细胞，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 × 107/ml ）； ．所使用的器皿。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； ．质粒的大小及构型的影响：质粒DNA不超过感受态细胞体积的5%分子量越大转化效率越低，超过30Kb的质粒DNA很难转化成功超螺旋的DNA具有较高的转化效率，重组DNA效率低一些，环状DNA相比线性DNA转化效率高一些1、 吸附－－双链DNA分子吸附于受体菌表面； 2、 转入－－双链DNA分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解； 3、 自稳－－外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链； 4、 表达－－供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。 受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到 自己的基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的。 DNA(质粒) 分子的受体细胞。 实验五：质粒DNA的酶切与鉴定 限制性核酸内切酶天然存在于什么生物体内？ 答：主要来自原核细胞、病毒、酵母菌原核细胞保护自己，选择性降解外源DNA的一种机制。包括两类酶，即限制性核酸内切酶和DNA甲基化酶。前者负责降解进入原核细胞的外源DNA，后者则对细胞自身的DNA进行甲基化，从而保护细胞的DNA，使其不被细胞内的限制性核酸内切酶降解。降解进入原核细胞的外源DNA，对细胞自身的DNA进行甲基化，从而保护细胞的DNA，使其不被细胞内的限制性核酸内切酶降解。I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链。尽管I型酶在生化研究中很有意义，但由于不产生确定的限制片段和明确的跑胶条带，因而不具备实用性。II型酶在其识别