胶乳微球偶联蛋白的使用中常见问题及解答.doc

胶乳微球使用中常见问题及解答 以下问题是我们用户在使用过程中遇到的问题，我们咨询了国外的技术人员，这是他们的答复） 问：产品说明书中给出的胶乳粒径是平均粒径吗？ 答：产品说明书中给出的胶乳粒径（Diameter）是平均粒径。 问：如何选择胶乳微球的粒径？ 答：一般选择粒径小的胶乳微球，则需要的抗体量就多，精密度和线性相对较好，而选择粒径大的胶乳微球性，则所需抗体少，精密度和线性相对较差，相对于小球，大球的灵敏度较好。 问：一般情况下我们所使用的微球的浓度大概是多少？ 答：整个测定体系中，微球的浓度大约在0.01%左右，当然这与试剂本身规定的线性有关系。 问：在使用离心方法偶联乳胶微球，一般需要多大的（相对）离心力？ 答：需要多大的离心力和所使用的乳胶微球有关，一般70nm左右的微球大概13000g/min 30min以上，粒径越小所需时间越长，离心力越大。 问：蛋白与微球偶联前，是不是微球的活化时间越长，效率越好？ 答：羧基微球的活化所需时间很短，一般以1-20分钟为宜，长时间的活化反而降低偶联效率。问：由于抗体不只是FC的氨基酸上有NH2，是不是表示它可以在任何方向与EDCA活化微球偶联呢？如果是这样，是不是会影响抗体与抗原的特异性反应？ 答： 事实的确如此，当然由于抗体的空间折叠方式和FC端疏水性强，因此偶联反应的绝大多数发生在Fc端，对抗体与抗原的结合的影响不大。问：微球与抗体联后，当时没发现有凝集，但隔夜后发现有凝集，这是什么原因？是偶联效率低的原因。当体系蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交联后还空出许多反应基团时，这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应，结果是把球又拉在一起了，所以有聚集。可以加一些 解决,常见的是BSA，另外，也可提高微球的交联率。但为什么是过一段时间后才出现凝集呢，这是因为微球偶联上蛋白后，相互之间由于携带同种电荷的关系，比较稳定（所以能以胶体样存在），只有当偶尔相互碰撞，遇上彼此的反应基团时才能结合。问：抗体偶联至羧基球，即时检测效果很好，但置于37度 2天后，抗体活性似乎下降很大，什么原因？如果，清洗，胶乳微球没有聚集。如果共价结合反应成功活失如此迅速，最常见的原因是质量差或过期出现一个自由流动白色粉末持续性团块，表明污染。问：问：⑴抗原和抗体匹配⑵包被的抗体量下足；⑶抗体使用量虽多，但偶联效率低。 问：微球表面基团种类及其反应 活化剂 与之反应之基团 生成化学键类型 羧基 EDC；EDC/(sulfo)NHS； CDI；CMPI 伯氨；仲氨 酰胺；仲胺 氨基 交联剂 硼氢化氰 羟基琥珀酰亚胺酯；醛基 卤乙酰基；氯甲基酯 酰胺；仲胺或叔胺 酰肼 交联剂 硼氢化氰 羟基琥珀酰亚胺酯 醛基 二酰基肼 还原型腙 环氧基 ? 氨基；巯基；羟基 仲胺；硫醚；醚 醛基 硼氢化氰；苯胺 酰肼；肼；氨氧基 腙；腙；肟 巯基 交联剂；四硫磺酸钠 4,4-联吡啶二硫醚 马来酰亚胺；卤乙酰基；二硫吡啶；；环氧基；羟基琥珀酰亚胺酯；乙烯砜 硫醚；硫醚；二硫化物 二硫化物；硫醚；硫醚 硫醚 羟基 CDI；对甲苯磺酰氯 溴化氰；DSC 双环氧基化合物 氨基；巯基；羟基 胺；仲胺；硫醚；醚 金属基 硫醇或二硫醇 硅羟基 硅烷 共价结合胶乳微球的参考方法（以下内容均为国外文献翻译过来的） A. 一步法 1. 配制50 mM 的MES反应缓冲溶液，pH值为6.00.23 ml的50 mg/ml NHS在去离子水中的溶液； d.19.2 mg/ml (100 mM)的EDAC在去离子水中的溶液（注5、6）； 2.在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌； 3.用MES缓冲液或纯化水洗涤胶乳微球悬浮物，除去未反应的NHS和EDAC； 4.重新将胶乳微球在去离子水中悬浮，使其浓度为1%（w/v）； 5.将结合的蛋白质溶于50-100mM 的MES缓冲溶液中，浓度为1 mg/ml； 6.立即加入蛋白质溶液（胶乳微球、蛋白质和缓冲溶液的浓度分别为0.5%(w/v)、0.5 mg/ml、25-50 mM）； 7.将混合物反应至少2小时，轻轻搅拌； 8. 按1ml反应混合液加入2.5 μl乙醇胺混合，搅拌反应10分钟； 9.除去未结合的蛋白质和乙醇胺，贮与适宜的贮存缓冲溶液中。 C、蛋白质与带醛基的胶乳微球反应 带醛基的胶乳微球是疏水性的胶乳微球，能吸附并能与蛋白质在中性pH条件下生成Schiff碱，这是脂肪族醛基与蛋白质的氨基发生的反应（赖氨酸的伯胺）。这些胶乳微球不需事先活化而生成共价链。Schiff碱的生成是可逆反应。此Schiff碱能被氰基氢硼化钠（sodium cyanoborohydride）反应还原至稳定的烷基胺。当肽类或其他有单一反应氨基的分子与带醛基的胶乳微球结合时，由于还原而趋向稳定。