Chelex―100法提取DNA用于差异甲基化基因座检测探究.doc

Chelex―100法提取DNA用于差异甲基化基因座检测探究 　　[摘要] 目的 通过对Chelex-100提取法提取的DNA用于酶切的研究，为差异甲基化在法医实际工作中的应用性研究提供一种快速提取酶切底物的方法。 方法 HhaⅠ酶切基因组DNA，PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳检测，254 nm紫外灯下观察。 结果 Chelex-100提取法提取的杂合子样本DNA加酶组只观察到来自父源的等位基因片段，而未加酶组能够观察到来自父源和母源的等位基因片段。 结论 Chelex-100提取法提取的DNA能够作为酶切底物应用于差异甲基化基因座的研究。 [关键词] 差异甲基化；聚合酶链反应；Chelex-100 [中图分类号] R446.64 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）04（a）-0107-03 [Abstract] Objective To provide a method of rapid extraction of enzyme substrate for differential methylation applied research in forensic practice by the study of the Chelex-100 extraction to extract DNA. Methods Genomic DNA was digested by HhaⅠ，with PCR amplification，detected with 2% agarose gel electrophoresis and observed under ultraviolet lamp，whose wavelength was 254 nm. Results The DNA samples with enzyme extracted by Chelex-100 from heterozygous observed was only the paternal allele fragments，while the paternal and maternal allele fragments were observed in the control group. Conclusion The DNA extracted with Chelex-100 extraction can be used as enzyme substrate，which is applied to study the differential methylation gene loci. [Key words] Differential methylation；polymerase chain reaction；Chelex-100 越来越多的研究资料表明，来自双亲的同源染色体或者等位基因有功能上的差异：有些只有父源的基因有转录活性，而母源的等位基因则一直处于沉默状态，另一些基因的情况则相反。这是由于来源于某一亲本的等位基因或其所在的染色体发生了表观遗传修饰，导致不同亲本来源的两个等位基因在子代细胞中表达不同。这种亲缘依赖的差异表达现象被称为基因组印记，受印记机制调控而差异表达的基因称之为印记基因[1]，许多与印记基因和印记控制中心邻近的序列存在DNA甲基化修饰及差异甲基化序列[2]，目前对于甲基化的研究多采用甲基化敏感性酶限制性内切酶-PCR法[3]。它是利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区不切割而对未甲基化区切割的特性，将DNA消化为大小不同的片段后再进行分析的一种研究甲基化的方法[4-5]。目前用甲基化敏感性限制性内切酶酶切的DNA大多是用有机溶剂法（酚/氯仿）提取或纯化的DNA，而未见Chelex-100法提取DNA作为酶切底物应用于差异甲基化基因座检测的报道。本研究对Chelex-100法提取的DNA应用于差异甲基化的检测进行了分析。 1 材料与方法 1.1 样品及试剂 100份无关人血由山西医科大学法医鉴定中心提供；HhaⅠ购自NEB公司；试验中引物由英潍捷基（上海）贸易公司合成，OPC纯度。Taq酶和Ex Taq Hot Start Version购自宝生物工程有限公司。 1.2 基因组DNA的提取 1.3 定量模板量 经典酚/氯仿法提取DNA的定量：紫外分光光度计测定OD260并定量；Chelex-100法提取DNA的定量：qPCR绝对定量。 1.4 筛选杂合子 1.5 对杂合子样本基因组DNA用甲基化敏感酶Hha Ⅰ消化 1.6 对甲基化敏感酶HhaⅠ处理过的杂合子基因组DNA用AB引物进行PCR扩增 1.7 以AB引物的扩