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In―Fusion克隆技术构建HBV X基因真核表达质粒 　　[摘 要] 目的：以血清中乙型肝炎病毒（HBV）DNA为模板，克隆构建HBV X蛋白质的真核表达载体pcDNA-HBx。方法：设计扩增HBV X基因的In-Fusion PCR引物，采用高保真DNA聚合酶分两段扩增HBV X基因序列；采用In-Fusion克隆技术，将两段X基因扩增片段一步克隆入经Hind III和Xba I双酶切的pcDNA3.0真核表达载体，以构建重组真核表达载体pcDNA-HBX；采用Hind III和Xba I双酶切和DNA序列测序筛选鉴定重组载体；pcDNA-HBx 转染HepG2细胞，Western blot检测pcDNA-HBx转染细胞的HBx蛋白质表达。结果：In-Fusion PCR引物分两段扩增获得全长HBx基因序列；In-Fusion获得克隆的pcDNA-HBx经双酶切筛选得到阳性重组质粒，测序分析证实插入序列正确；转染pcDNA-HBX的HepG2细胞，Western blot证实表达HBx蛋白质。结论：以血清HBV DNA为模板克隆HBV X基因，构建了表达HBV HBx蛋白质的真核表达载体，为HBx蛋白质的生物学功能研究提供支持。 [关键词] 乙型肝炎病毒；HBV X基因；基因克隆；表达载体；真核表达 中图分类号：R511 文献标识码：A 文章编号：2055-5200（2014）02-001-05 慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus， HBV）感染是肝癌发生的主要危险因素之一。HBV 编码的分子中与肝癌发生关系最密切的是X蛋白质，HBV X基因编码的X蛋白质（the hepatitis B virus X，HBx）具有多种生物学功能，可与宿主细胞多种蛋白质相互作用，调控宿主细胞基因表达，影响宿主细胞的信号转导、细胞增殖与分化等，其对肝细胞周期与凋亡的影响是HBV致肝癌发生的重要机制之一[1-3]。因此，克隆HBV X基因进行HBx蛋白生物功能研究具有重要意义。 由于血清HBV DNA X基因的特殊结构，使得克隆X基因较为困难。血清HBV病毒颗粒的基因组长约3.2kb，为带有缺口的双链不完全环形结构DNA，称为松弛环状DNA（rcDNA），而X基因位于HBV基因组的1374bp～1838bp，正位于缺口处，而且该区域为高CG区。实验发现：当以血清HBV rcDNA为模板时，用普通PCR一次扩增全长X基因，或用PCR分段扩增后再用PCR扩增拼接的X基因，所获得全长X基因扩增片段经常会出现序列缺失现象[4]。 为克服上述问题，我们采用In-Fusion克隆技术，将分段扩增的X基因片段一次连接克隆入真核表达载体中。In-Fusion克隆技术是利用In-Fusion Enzyme可准确将末端带有15个相互重叠碱基序列的DNA片段融合连接的特性，将一个或多个外源基因片段一次克隆入目的质粒中[5-6]。目的克隆基因片段末端的15 bp重叠碱基序列，是通过特定设计的In-Fusion引物加到扩增片段的末端。In-Fusion HD Cloning Kits 试剂盒可快速准确地将一个或多个外源DNA片段克隆到载体任何位置[7-8]。采用In-Fusion技术，以血清HBV DNA为模板，分段扩增并拼接X基因，将X基因准确地克隆入真核表达载体pcDNA3.0，获得了可表达HBx蛋白质重组真核表达载体。为HBx蛋白质的生物学功能研究提供实验条件。 1 材料与方法 1.1 主要实验材料及仪器 表达载体pcDNA?3.0购自美国Invitrogen生命技术公司；高保真PCR扩增反应液2×Pfu PCR MasterMix、TIANamp病毒DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶DNA 回收试剂盒、感受态Top10购于天根生化科技（北京）有限公司；限制性内切酶HindIII和Xba I、In-Fusion HD EcoDryTM Cloning Kit 购自宝生物工程（大连）有限公司；HepG2细胞株购于中国典型培养物保藏中心；鼠抗HBxAg单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体购于圣克鲁斯（Santa Cruz）生物技术公司；NanoDrop2000核酸浓度分析仪（赛默飞世尔科技中国有限公司）。根据HBV rcDNA X的结构特点，拟分HBX1和HBX2两个片段扩增X基因，然后进行In-Fusion融合连接克隆，所用扩增引物（表1）用http：///infusion/在线软件设计；化学发光底物（BeyoECL Plus Reagent A， B，D3308）。 表1 用于In-Fusion分段拼接克隆的 PCR引物序列 引物 引物序列 HBV基因组位置 P