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不同方法从绞股蓝种子中提取基因组DNA探究 　　摘 要：以绞股蓝种子为研究材料，采用改良的CTAB法、改良的SDS法和高盐低pH法对绞股蓝基因组DNA进行提取，对提取效果采用紫外分光光度计检测、琼脂糖凝胶电泳和RAPD进行综合比较分析。结果表明：3种提取方法所获得的DNA，其OD260/OD280多数都在1.80～2.00，琼脂糖凝胶电泳结果也显示DNA 的质量很好，改良的SDS法提取效率显著好于改良的CTAB法和高盐低pH法；而且改良的SDS法提取的DNA的RAPD图谱条带最亮、最清晰。因此，从DNA产量、质量等方面综合考虑，改良的SDS法为绞股蓝种子DNA提取的有效方法。 关键词：绞股蓝；基因组；CTAB法；SDS法；高盐低pH法 中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）18-22-03 绞股蓝（Gynostemmna pentaphullum（Thumb）Makino）为葫芦科多年生蔓生藤本植物，含有多种皂甙成份、黄酮类物质及多种氨基酸、维生素、微量元素等，系统的药理学和临床医学研究证明绞股蓝有抗疲劳、增强免疫力、消除激素类药物的副作用、降血脂、降血压、减肥、抗动脉粥状硬化、抗冠心病、健胃增食、改善睡眠、乌发养颜等多种保健功效[1-3]。 从绞股蓝提取高质量DNA是进行绞股蓝分子生物学研究的基础，而绞股蓝是多年生植物，富含酚类物质和多糖，一些常规DNA提取方法在提取多年生植物材料时，难于去除多酚杂质和多糖，常出现获得的DNA产量低，质量差，产品DNA易降解等问题，有时甚至不能用作相关的DNA研究；并且绞股蓝发芽率低，需经过长时间培养才能长出幼苗。因此，本文选用绞股蓝种子作为研究材料，针对其具体特点，在常规的提取方法SDS法[4-5]、CTAB法[6-8]、高盐低pH法的基础上进行适当的改进。通过对提取效果进行比较分析，旨在找到一种简便、快捷而又经济的高质量绞股蓝种子基因组DNA的提取方法，为绞股蓝DNA多态性分析及DNA分子辅助选择研究提供技术基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料 绞股蓝种子购置于安康平利县百草堂科技有限公司绞股蓝种质资源圃基地。 1.2 试剂和仪器 CTAB、SDS、EDTA、PVP，Taq酶、dNTP、引物及其他药品均购于上海生物工程公司。HZS-H水浴振荡器，UV-2100型紫外可见分光光度计，GL-20G-Ⅱ高速冷冻离心机，TGL-16G台式离心机，恒压、恒流DF-D电泳仪，UV-ⅥA型紫外透射反射仪。 1.3 提取方法 根据绞股蓝种子富含多酚多糖等特点，以常规SDS法、CTAB法和高盐低pH值法为基础，称取100mg绞股蓝种子于预冷研钵中，加入玻璃砂迅速研磨成细粉状后，立即转入1.5mL的灭菌离心，经优化各提取步骤，得到改良SDS法、改良的CTAB法和改良的高盐低pH法。 1.3.1 改良的SDS法 （1）裂解。向上述离心管中加入 500μL DNA 提取液（100mmol/L Tris-HCl（pH8.0），50mmol/L EDTA（pH8.0），1%（w/v）PVP-40，1.4mol/L NaCl，用前加β-巯基乙醇至终浓度为2.5%）500μL，混匀后加入80μL 10% SDS，65℃水浴15min（间隔晃动3次）。加入100μL 5mol/L KAc，混匀后冰浴30min。 （2）离心。将样品管于 12 000r/min 离心5 min，离心后将上清液小心转移到吸附柱中，室温放置2～3 min，12 000 r/min离心1min，离心后将上清液再次转移到同一吸附柱中，12 000r/min 离心 1min，弃废液。 （3）漂洗。向离心管中加入 500μL 70% 乙醇 ，振荡起沉淀数秒钟，12 000r/min 离心 1min，弃废液；重复1次。去上清液后再重复洗涤沉淀1次。风干后溶于适量TE缓冲液。得到的样品于冰箱-20℃保存备用。 1.3.2 改良的CTAB法 （1）裂解。向上述离心管中加入500 μL DNA 提取液（2% CTAB，1.4mol/L的NaCl，20 mmol/L的EDTA，100 mmol/L TrisCl，0.1%β-巯基乙醇，pH 8.0），65℃水浴15min（间隔晃动3次）。加入100μL 5mol/L KAc，混匀后冰浴30min。 （2）离心。离心管稍冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），静置分层后，在4℃，12 000r/min下离心10min，取上清液加入1/3体积无水乙醇轻微混匀后加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀，立即10 000r/min下离心10min，缓慢吸取上清液于1.5mL离心管中，上清液中加入浓度