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乳牙牙髓基质细胞原代培养和矿化诱导 　　【摘 要】目的：分离培养儿童乳牙牙髓基质细胞，比较研究矿化诱导前后钙盐形成的差异。方法：牙髓取材自10名8～10岁儿童拔除的滞留乳磨牙，通过组织块贴壁法获得乳牙牙髓基质细胞，并在含体积分数10%FBS的DMEM培养基中原代培养14d，消化传代后用添加有10 mol/L地赛米松，50mg/L左旋抗坏血酸，10nmol/L维生素D3，10mmol/Lβ-磷酸甘油钠的DMEM培养基诱导培养14天，观察细胞形态变化和生长规律，通过茜素红染色比较诱导前后钙盐形成的能力。结果：乳牙牙髓基质细胞呈成纤维细胞样贴壁生长，经矿化诱导14天后细胞由梭形转变成多角形和柱形，胞核大而圆，形成了钙化结节。而未经诱导的细胞仍为梭形，未见钙化结节的形成。结论：乳牙牙髓基质细胞经矿化诱导培养后可以在体外形成钙化结节，可以尝试作为组织工程牙再生研究新的种子细胞。 【关键词】乳牙；牙髓；基质细胞；细胞培养；矿化 【中图分类号】R780 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0164-02 牙齿作为颌面部特殊的独立器官，其修复一直为人们所关注，而现有的临床方法实在不尽人意。国内外学者多致力于应用组织工程技术进行牙再生的研究，其中一项重要的工作就是寻找合适的种子细胞[1]。牙髓细胞是当前研究的中心，过去对于人牙髓细胞的研究主要集中于恒牙牙髓的研究，本试验拟通过培养人类乳牙牙髓细胞，为研究乳牙牙髓特性、乳恒牙替换和发育等奠定基础，并摸索乳牙牙髓基质细胞向成牙本质细胞分化的诱导条件，为牙再生找寻新的种子细胞。 材料和方法 1.材料与设备 地塞米松，L-抗坏血酸，β-磷酸甘油钠，维生素D3（以上试剂购自美国Sigma公司）；胎牛血清（FBS），DMEM培养基，胰酶-EDTA，HEPES（以上试剂购自美国Gibco公司）。CO2细胞培养孵箱（美国Forma公司），超净工作台（苏州净化总厂），低温高速离心机（德国Heraeus公司），倒置显微镜（美国Olympus公司）。 2.乳牙牙髓基质细胞的分离及原代培养：乳牙来自临床上拔除的滞留松动乳牙，供体为10名8～10岁儿童，排除传染病及内分泌疾病史，乳牙排除牙体牙髓疾病。离体乳牙立即置于含抗生素（青霉素500U/ml，链霉素500mg/ml）的DMEM培养液中，在超净工作台内用生理盐水冲洗后，75%酒精擦拭，无菌条件下取出牙髓组织，将牙髓组织剪成1mm3大小碎块，均匀铺于无菌的培养瓶底，加入10%FBS的DMEM培养液于37℃，5%CO2条件下孵育。 3.乳牙牙髓基质细胞的矿化诱导培养：用0.53mmol/L的EDTA及质量分数为0.05%胰酶消化贴壁的乳牙牙髓基质细胞，3～5min后用含体积分数为10%FBS的DMEM培养基中和胰酶，300g离心3×5min以充分清除EDTA残余，再用DMEM培养基（内含体积分数为10%FBS， 10 mol/L地塞米松，50mg/L左旋抗坏血酸，10nmol/L维生素D3及10mmol/L β-磷酸甘油钠）培养细胞，对照组仅用DMEM培养基。 4.诱导前后茜素红染色比较：将诱导后的牙髓基质细胞爬片用茜素红S染液染色5min，丙酮速洗，二甲苯透明，置于光学显微镜下观察钙盐分泌情况。 结果 1.乳牙牙髓基质细胞原代培养： 乳牙牙髓组织块贴壁后2天开始有细胞爬出，以组织块为中心呈放射状排列，细胞增殖极快，约10d可达80%融合。贴壁的细胞大部分呈梭形的单层成纤维细胞样细胞，胞体细长、伸展良好、胞浆均匀、核圆、核仁清晰，其间也可见形态、体积不一的多种细胞成分。细胞传代后可见部分细胞呈克隆样生长。 2.乳牙牙髓基质细胞矿化诱导培养后茜素红染色： 传代的乳牙牙髓基质细胞经矿化诱导培养5～7d，倒置显微镜下观察其形状由细长梭形转变成棱形或多角形，细胞浆丰富，细胞排列呈一定的极性，并有少数细胞有细长的突起。诱导21天后，可见部分细胞聚集形成结节状，茜素红染色结果呈强阳性，可见细胞内外有呈淡红色，结节处呈深红色，提示诱导后细胞可以形成钙盐沉积。而对照组未诱导的牙髓基质细胞未见矿化结节的形成。 讨论 牙齿作为颌面部独特的器官之一，无论对于人体的功能还是美观都具有重要的意义，而牙齿的缺损或缺失更是极为普遍，它的修复一直为人们所关注，而现有的治疗和修复方法实在不能令人满意。近年来国内外学者一直地寻找合适的种子细胞，1999年Harada等以鼠的切牙为模型，发现鼠切牙根尖处颈环的星网层存在有干细胞；2000年Gronthos等在体外成功培养并鉴定了人牙髓干细胞；Young等报道猪的牙胚组织中存在有上皮和间充质干细胞；牙髓干细胞的发出及概念的确立有助于我们