人炎症牙周膜干细胞与牙周膜干细胞体外分离、培养和鉴定.doc

人炎症牙周膜干细胞与牙周膜干细胞体外分离、培养和鉴定 　　【摘要】 目的 体外分离培养人的炎症牙周膜干细胞和正常的牙周膜干细胞，并从形态学和表面分子表达率比较两种细胞的差别，为体外分离、培养炎症牙周膜干细胞提供理论依据。方法 体外酶消化组织块法培养牙周炎患者的炎症牙周膜干细胞（iPDLSCs）和正常的人的牙周膜干细胞（PDLSCs），体式显微镜下观察细胞表面形态，流式细胞仪检测表型分子CD90、CD29、CD105、CD31、CD45、STRO-1进行干细胞鉴定。 【关键词】 牙周膜干细胞；炎症 【中图分类号】R781.4 【文献标识码】A 【文章编号】1004-4949（2013）06-11-03 牙周炎导致牙周支持组织破坏，是成人失牙的主要原因[1]。牙周治疗的主要目的是控制牙周组织炎症，维护牙周组织健康，并使包括牙槽骨、牙骨质、牙周膜、牙龈在内的牙周组织达到形态和功能上的再生与重建，这也是牙周病治疗的终极目标[2-4]。近年发展起来的组织工程技术为牙周组织再生治疗开辟了新途径，种子细胞、信号分子和支架是牙周组织工程技术的三大要素，因此合理选择种子细胞是牙周组织工程技术获得成功的关键[5-6]，目前已确认可用于牙周组织工程技术的种子细胞有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和牙周膜干细胞等[7-9]，其来源多为健康的人体组织，通常存在取材有创、来源有限等弊端，在一定程度上限制了临床治疗的可行性。许多研究表明在牙周炎时期也存在着组织的再生，而组织的再生离不开干细胞的迁移，只有适当类型的干细胞附着于根面，增殖并分化为功能性附着结构（牙骨质-牙周膜-牙槽骨）的各种细胞组分，配合适宜的刺激因子和基质成分，才可能形成再生组织，否则可能仅产生修复[10]。Lin 等[11]对3名重度牙周炎（Ⅲ度根分叉病变）患者需要拔除的患牙行 GTR 手术，术后6周，切取其中2名患者患牙周围的再生组织，进行免疫组化检测，发现了STRO-1、CD146 和CD44 阳性的细胞，同时拔除余下1名患者的患牙，取其再生组织进行细胞体外培养并传代，用流式细胞仪分析得到 STRO-1、CD146 和 CD44 阳性的细胞百分比分别为78.3%、94.9%和100%，所得细胞经矿化和成脂诱导 4周后可分别形成矿化结节及脂滴，但其分化能力低于PDLSCs 和BMSCs。该实验证明了牙周炎症再生组织中应该存在具有干细胞特性的细胞。Chen 等[6]将临床上因重度牙周炎而拔除的患牙制成组织切片，使用免疫组化染色观察发现，在牙周炎患牙的牙周组织中，STRO-1、CD146 和CD44 阳性细胞分布情况与健康牙周组织近似，而牙周膜干细胞表面的阳性标记物是STRO-1、CD146、CD90、CD29、CD105、阴性标记物是CD31 CD45，所以本实验利用STRO-1、CD146、CD90、CD29、CD105、和CD31 CD45对牙周膜干细胞和炎症牙周膜干细胞（i-PDLSCs）进行鉴定。 1 材料和方法 1.1 主要试剂 1.2 主要器械： 眼科剪、眼科镊、刀柄、11 号刀片、平底培养皿、25cm2培养瓶、10ml离心管、平底 6 孔板（Corning，美国）、金属滤器。 1.3 主要实验仪器 1.4 实验方法 1.4.1 原代细胞的培养： 1）炎症牙周膜干细胞的培养（iPDLSCs）：取材：选取临床上年龄在 30-45 岁之间的慢性牙周炎患者，收集其因重度牙周炎需要拔除的患牙，患牙无牙根吸收、根尖周炎和根尖囊肿等牙髓和根尖周疾病，刮取其炎症牙周膜组织；漂洗组织：将获得组织用 8 万 U 庆大霉素浸泡 3-5min，用 PBS 反复漂洗 3 遍，将其剪成约 2mm×2mm×2mm 大小的组织块；消化与接种：把漂洗后的组织块收集到离心管中，然后加入1-2ml胶原酶，置于含有5% CO2、37℃二氧化碳培养箱中消化，每15min 摇动离心管一次，40min后拿出，然后吹打均匀，以800rpm 离心 6min，弃去上清液，加入2ml培养液（含10%胎牛血清、200U/ml 庆大霉素和 100U/ml 青霉素的α-MEM，下同）再次吹打均匀，接种于 6孔板中，置于二氧化碳培养箱中培养（5% CO2，37℃），每3d换液一次。2）健康牙周膜干细胞的培养（PDLSCs）：取材：选取临床上年龄在 20-35 岁之间的非牙周炎患者，收集其因正畸需要所拔牙齿或拔除的无炎症的阻生第三磨牙，刮取其根中部 1/3 牙周膜；消化与接种：将获得组织用 PBS 漂洗 3 遍，余步骤同上。 1.4.2 细胞的纯化： 本次试验使用有限稀释法对iPDLSCs和PDLSCs进行纯化，显微镜下观察原代细胞铺满6孔板底达 80%汇合时，弃去原培养