壮筋续骨汤对骨折大鼠血清bFGF与TGFβ1水平影响与意义.doc

壮筋续骨汤对骨折大鼠血清bFGF与TGFβ1水平影响与意义 　　[摘要] 目的 研究壮筋续骨汤对大鼠股骨骨折后血清碱性成纤维细胞因子（bFGF）和转化生长因子（TGFβ1）水平以及骨折愈合的影响。 方法 成年健康雄性Wistar大鼠72只，应用电锯在股骨中段切断股骨制备骨折动物模型，壮筋续骨汤水煎液灌胃干预治疗。大体解剖观察骨折局部的愈合情况，组织病理学观察骨痂结构，酶联免疫吸附试验检测血清bFGF和TGFβ1水平。 结果 解剖观察发现，骨折后7d骨折断端主要为肉芽组织，14d为纤维性骨痂，21d可见骨性骨痂，模型组与治疗组未见显著差异，28d治疗组骨痂重塑质量明显优于模型组。大鼠血清bFGF和TGFβ1水平，模型组与治疗组在骨折后7、14、21d无显著差异，在28d治疗组明显高于模型组。 结论 壮筋续骨汤可能在骨折愈合后期通过维持血清bFGF和TGFβ1的水平、增强其活性、减缓其降解而促进骨折愈合。 [关键词] 壮筋续骨汤；骨折；bFGF；TGFβ1；大鼠 [中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）03-27-04 骨折重塑修复是一个极其复杂的病理生理过程，现代医学以复位、固定、功能锻炼等物理治疗手段为主。从20世纪80年代才开始对影响骨折愈合的生物因子进行研究[1]，近几年成骨诱导研究成为热点，并已进入临床实验和应用阶段[2]。骨折后局部坏死的骨细胞、成骨细胞和被吸收的骨基质均可向骨折周围释放生长因子[3]。在众多细胞因子中， 碱性成纤维细胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）[4]和转化生长因子（transforming growth factor，TGFβ1）[5]的作用尤为突出。中医药治疗骨折有其独特优势，许多中药活性成分有促进骨折愈合、修复和改建作用，黄培军等[6-7]研究发现，壮筋续骨汤联合内固定疗法治疗骨折均可获得较单纯内固定更好疗效，但其作用机制仍然不甚清楚。本实验试图观察壮筋续骨汤对大鼠股骨骨折后血清bFGF和TGFβ1水平影响及其对骨折愈合促进作用机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物分组 成年健康雄性清洁级Wistar大鼠72只，年龄3个月，体重230～250g，购自青岛市药物检验所动物中心：SCXK（鲁将动物适应性饲养7d，然后随机分为对照组24只、模型组24只、治疗组24只。 1.2 制备骨折模型[8] 应用10%水合氯醛腹腔注射（300mg/kg）麻醉动物，俯卧固定，碘酒消毒，经股外侧切口，分离股前、外侧肌间隔直至股骨，在股骨中段（大转子下1cm）用低速牙科钻（JBX-NE22，NSK Co. Ltd. Japan）锯断股骨，应用克氏针（直径1mm）髓腔逆行固定，然后逐层缝合，喷洒青霉素注射液，无菌包扎切口，手术成功率100%。对照组动物不切断股骨，然后逐层缝合切口，无菌包扎切口。术后即刻拍摄X线片，然后将动物放置笼中，每笼1只，单独饲养。 1.3 治疗方法 壮筋续骨汤（出自清代医学家赵濂所著《伤科大成》）由壮筋续骨丹演化而来，依据《医疗机构中药煎药室管理规范》（国中医药发〔2009〕3号）制备[9]。每副中药充分煎煮两次，最终药液为224mL，含生药112g，浓度0.5g/mL。根据前期研究结果证实，每日1.25g/kg（2.5ml/kg）较为理想[9]。本实验以1.25g/kg（2.5ml/kg）定量喂养，每日1次，连续28d。对照组和模型组同步给予等量的生理盐水。 1.4 评价指标 治疗后7、14、21、28d，每组各取6只动物观察应用一下方法观察研究。 1.4.1 大体观察 治疗结束后，在相应时间点大鼠应用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，完整取出股骨，生理盐水洗涤残存血迹，照相记录骨折愈合情况。 1.4.2 组织病理 将股骨置4%多聚甲醛中固定24h，蒸馏水浸泡4h，再置于20%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液脱钙15d。然后截取骨折处上、下1.0cm部位的组织（包括血肿、骨痂组织），常规乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，应用切片机（Leica2015，上海）沿股骨纵轴切片，厚5μm，贴于载玻片。苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察骨痂的组织结构。 1.4.3 酶联免疫吸附试验（ELISA） 动物麻醉后，经腹主动脉取血（4mL），普通离心机4000转/min离心10min，分离血清（2mL）。采用双抗夹心ELISA试剂盒（Blue Green公司）测定大鼠血清bFGF和TGFβ1的水平。按试剂盒说明书操作，向特异性抗体包被酶标板中每孔加血清标本100μL，37℃孵育2h，双蒸水洗涤5min×3