定量指纹图谱在醒脑通络注射液氨基酸成分研究中应用.doc

定量指纹图谱在醒脑通络注射液氨基酸成分研究中应用 　　[收稿日期] 2013-10-09 [基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（2011ZX09401-014） [通信作者] *萧伟，研究员级高级工程师，博士，研究方向为中药新药的研究与开发，Tel：（0518E-mail：wzhzh-nj@163.net [作者简介] 胡军华，工程师，主要从事药物分析与质量标准研究，TelE-mail：hujunhua2001@163.com [摘要] 目的：采用定量指纹图谱对醒脑通络注射液成品中的氨基酸成分进行控制，以此来评价其产品的质量。方法：采用AccQ Tag柱前衍生的方法，建立醒脑通络注射液中氨基酸成分的定量指纹图谱方法，对10批醒脑通络注射液中的各氨基酸进行定量检测，并结合10批成品的相似度指标，综合评价其质量。结果：醒脑通络注射液中含有12种氨基酸，各氨基酸特征峰定量结果均一、稳定，10批成品指纹图谱相似度在0.90以上。结论：该方法准确、可行，是一种简便、有效的中药质量评价手段。 [关键词] 醒脑通络注射液；定量指纹图谱；AccQ Tag柱前衍生；氨基酸 醒脑通络注射液是由江苏康缘药业股份有限公司研发的中药注射剂，处方由水牛角、地黄、黄芩、三七、赤芍、人工麝香共6味组成，临床上用于治疗脑出血性中风[1]。本研究参照《中国药典》2010年版一部附录[2]的要求及文献[3-10]采用AccQ Tag柱前衍生法建立了成品中的氨基酸指纹图谱，并对各氨基酸进行了定量研究，建立了较全面的氨基酸质量控制方法，以更为有效快捷的控制醒脑通络注射液的内在质量。 1 材料与方法 1.1 材料 Waters2695-2487高效液相色谱仪（美国沃特斯特公司），电热恒温鼓风干燥箱（上海新苗公司），快速涡旋混合器（美国安胜科技有限公司）。AccQ Tag 氨基酸测定试剂盒（包括AccQ Flour氨基酸专利衍生剂、专用氨基酸分析柱、玻璃样品衍生管）、17种混合氨基酸标准液（浓度均为2.5 molmL-1） 美国Waters 公司；乙腈（色谱纯）。水 （超纯水 ）；其余试剂均为分析纯。醒脑通络注射液来自江苏康缘药业股份有限公司。 1.2 色谱条件 AccQ Tag色谱柱（3.9 mm×150 mm， 5 μm）柱；柱温37 ℃；流动相A：按1∶10将AccQ TagA浓液用水稀释，流动相B：乙腈，C：高纯水，梯度洗脱程序见表1。流速1 mLmin-1；检测波长248 nm；进样量10 μL，理论板数按苏氨酸峰计算应不得低于4 000。 1.3 对照品溶液的制备 用移液器移取17种氨基酸的标样100 μL，加0.90 mL水稀释，混匀，备用。该标准溶液的氨基酸浓度为0.25 molL-1。精确吸取10 μL于衍生用小管中（6 μm×50 mm），加入70 μL 硼酸盐缓冲液，涡旋混合后，在涡旋状态下加入20 μL 刚配好的AccQ Fluor 衍生剂，保持涡旋混合15 s。室温放置l min 后用石蜡膜封口，于50 ℃烘箱内加热10 min，取出冷至室温，即得。 1.4 供试品溶液的制备 精密吸取醒脑通络注射液1 mL，置10 mL量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。 1.5 空白溶液的制备 以纯化水作为空白溶液。 1.6 衍生方法 ①将烘箱开启并恒温至55 ℃；②用清洁的移液管分别取参照物溶液、供试品溶液及空白溶液各10 μL，分别注入6 μm×50 mm的衍生管底部；③换一清洁移液管头，加AccQ Fluor硼酸盐缓冲液70 μL至衍生管中，涡旋混合；④另换一清洁移液管头吸取20 μL刚刚配好的AccQ Fluor衍生剂，在涡旋状态下加到衍生管中，并保持涡旋混合10～15 s；⑤在室温下放置1 min；⑥将衍生管用封口膜封口，放在55 ℃烘箱内加热10 min，取出移入100 μL的进样管，即得。 分别精密吸取衍生后的参照物溶液、供试品溶液及空白溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。 2 结果与分析 2.1 指纹图谱方法验证与检验 2.1.1 指纹图谱方法学考察 比较各批号醒脑通络注射液样品的指纹图谱，含有13个共有色谱峰，各峰分离度良好，分离度在规定范围内，见图1。 1.丝氨酸；2.谷氨酸；3.甘氨酸；4.精氨酸；5.苏氨酸（S）；6.丙氨酸；7.脯氨酸；8.缬氨酸；9.赖氨酸；10.异亮氨酸；11.亮氨酸；12.苯丙氨酸。 图1 醒脑通络注射液指纹图谱 Fig.1 Fingerprint of Xingnao Ton