细胞分离分析仪器--离心机.ppt

（二）密度梯度离心(isodensity centrifugation) 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。按照离心分离原理，密度梯度离心又可分为两种类型： 速率区带离心法（ rate-zonal) 等密度离心法（ Isopyonic ） * 优点： ①分离效果好，可一次获得较纯颗粒。 ②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒。 ③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性。 * 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖、甘油。 分离活细胞的介质要求： 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）PH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。 对于大多数离心来讲，蔗糖是比较合适的梯度材料。尽管它在高密度（30% W/N）时粘性较大，但综合比较表明它可以广泛应用。当蔗糖分离一些对渗透性敏感的生物体组份时，其高渗透性就会对样品有影响，这时需要选择其他梯度材料，如由pharmacia公司开发的Ficoll等等。 * 1. 速率区带离心法 velocity sedimentation 用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。 * 操作注意事项 1.先在离心管中装入密度梯度介质。然后将预分离样品混入一起离心。 2.梯度液在离心过程中及离心完毕应该避免因为震动而引起的粒子再混合。 3.离心的时间要严格控制，如果时间过长，所有样品可能全部到达离心管的底部；离心时间不足，样品则还没有完全分离。 * 用途：分离密度相近而沉降速度不等的细胞或细胞器。 * 2.等密度沉降法 isopycnic sedimentation 原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。 特点： 介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。 力场比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速离心。 用途：分离密度不等的颗粒。 * 操作注意事项 预先配置介质的密度梯度溶液，将介质和预分离样品混合或者是置于梯度溶液顶部。 离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。 一旦达到了平衡，再延长离心时间也不能改变粒子的成带位置。 等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝（CSCl），其密度可达1.7 g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。 * Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation * 蔗糖 密度 梯度 溶液 的制 备 将5%、10%、20%、30%蔗糖溶液各10mL，按浓度依次减小的顺序逐个铺入离心管中即制成不连续阶梯密度梯度。此离心管于20-25℃静置2--3h，通过重力作用即成接近线性的连续密度梯度液。 若用细铁丝轻敲离心管，静置时间可以缩短至0.5-1h。温度低时所需静置时间较长，温度高时则较短。为减少对流，静置后应将离心管置冰浴中备用。 小鼠肝脏线粒体蛋白的制备 * 梯 度 离 心 （1）在每个离心管内的梯度溶液表面，分别加入1.0mL样品溶液。加样时，用注射器吸入样品，在梯度溶液表面上方0.5mm左右，沿管壁慢慢加入。不允许自由滴落，也不允许针头接触梯度液面。 （2）装好样品后，小心拧紧离心管帽，装好套筒、转头，按使用程序启动超速离心机，在0℃以25000r/min离心分离1～3h。 * 梯度 溶液 的分 部收 集 离心后，取出离心管，置于冷室中。用No.22针头将聚乙烯离心管底部正中位置穿刺，梯度溶液慢慢流出。用小试管将流出的梯度溶液分部收集，每管25滴。 * 收集区带的方法有许多种： （1） 用注射器和滴管由离心管上部吸出。（2） 有针刺穿离心管底部滴出。（3）?用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。（4）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。  * 离心方法的选择 1.根据实验室固有的protocal进行离心条件的选择。 2.根据参考文献进行离心条件的确定。 3.依据离心机的型号、预离心物质的理化性质（沉降速度、密度大小等）来选择离心条件，并不断优化以达到最佳的分离效果。 * 例如：线粒体的分离 * （三）分析离心法 分析性离心法：