shRNA双表达载体pCSH1的构建及抗肿瘤活性研究.pdf

蔓国医药生物技术 2010年8月第5卷第4期 ChinMedBiotechnol，August2010，Vo1．5，No．4 DOI：10．3969／craba．j．issn．1673—713X．2010．04．002 · 论 著 · shRNA双表达载体pCSH1的构建 及抗肿瘤活性研究 何红伟，李保卫，任开环，邵荣光 【摘要】 疾病治疗手段，具有干扰特异性高、可 同时干扰 目的 构建一种可同时表达靶 向两种基因 shRNA 的瞬 多个基 因的特 点[1-3]。与化学合成小干扰 RNA 时表达载体，以提高 RNA 干扰效率和降低载体的非特异 (siRNA)及短发夹 RNA (shRNA)病毒表达载体 毒性。 法相 比，shRNA 非病毒表达载体法介导的多靶点 方法 载体采用 pUC19的质粒基本序列，RNA 聚合酶 III RNAi操作简便、成本低、干扰效果稳定且安全性 识别的 H1启动子，并利用同尾酶的特性设计两个多克隆 高l4J。但 shRNA 表达质粒有时可以促发干扰素效 位点，用 DNA 重组技术构建了载体 pCSH1；以 pCSH1为 应，这种非特异性作用与浓度有密切关系，在需要 基础，构建靶向 N．Ras或 c-Myc的单干扰载体，以及靶 同时抑制两个或多个基因时往往受到很大的限制。 向 N—Ras和 c．Myc的双干扰载体，并验证其干扰效率； 所以本研究设计并构建了一种可用于同时表达两 并用克隆形成法验证了载体的抗肿瘤活性；此外还将靶向 种 shRNA 的载体 pCSH1，在对两个靶基因产生有 N—Ras两个 shRNA 转录单位串联到一个载体中，检测该连 效的特异 RNA 干扰的同时降低载体的用量，从而 接方式的优势。 减少非特异性作用。 结果 成功设计并构建了可同时表达双基因 shRNA 的瞬 1 材料与方法 时表达载体 pCSH1。对该载体的验证结果表明，靶向 N—Ras 1．1 主要材料 的单干扰 shRNA 表达载体 pCSH1．shNR 或靶向 c．Myc 的单干扰 shRNA 表达载体 pCSH1一shMyc对靶基 因 质粒 pUC19，人肝癌 HepG2细胞本室保存； mRNA 和蛋 白具有明显的干扰作用；双干扰载体 pCSH1一 pSilencerH13．0购 白美 国 ambion公司；TRIzol、 shNM 也能同时抑制 N—Ras和 c—Myc的 mRNA 和蛋 白 RT-PCR试剂盒购 自美国 Invitrogen公司；N—Ras、 表达水平，且对细胞克隆形成的抑制率最高。细胞生长 曲线 c．Myc、~-actin单克隆抗体均购 白美国 SantaCruz 公司。 法检测两个 N—Ras—shRNA 表达单位串联的载体 pCSH1— 1．2 方法 2shNR 对细胞生长的抑制作用 ，结果显示在质粒质量相同 1．2．1 可 同时表达多种基因 shRNA 的载体 条件下，双表达载体 pCSH1．2shNR对细胞的生长抑制作用 显著强于单 N．Ras—shRNA 表达载体 pCSH1一shNR，而相同 pCSH1的设计与构建 为了实现将两个 shRNA 转录单位 串联在一个载体上的 目的，利用同尾酶的 质量的对照质粒 pCSH1—2shMock、pCSH1一shMock对细胞 特性，需要在 shRNA 转录单位两侧选择一对同尾 生长的抑制