感受态细胞的制备与质粒转化.ppt

四、注意事项 四、注意事项 四、注意事项 五、质粒DNA转化常见问题 五、质粒DNA转化常见问题 * * 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Competent cells)。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。 一、实验原理 实验四 感受态细胞的制备与质粒DNA的转化 所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理状态。 关于感受态的本质与存在，说法很多， 目前主要有两种假说： １．局部原生质体化假说－－感受态细胞的表面形成一种能接受ＤＮＡ的酶位点， 使ＤＮＡ分子能进入细胞。 1、感受态细胞的制备 CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本原理是：细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。 （一）CaCl2 转化法核心：目标细胞在 CaCl2·H2O 溶液中浸泡一段时间， 转化效率 107-109 cell/?gD 。??????NE.coli: DH5?, TG1, XL-1Blue, JM105???（1）冰上 30min ???（2）热激 42℃ 90“???（3）恢复 1～2min???（4）复苏 37℃ 45-60 min（二）原生质体转化法（protoplast）适用于 G+ 细菌，特别是芽胞杆菌、酶母。过程：???（1）等渗环境下，脱细胞壁（Lysozyme）????（2）细胞壁再生（三）电转化法（electroporation）缓冲液：10% 甘油或蔗糖，含（或不含） Mg2+ 离子。转化条件：2.5 KV/0.2cm 25?F 200-400?。 ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解； ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成双链； ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。 2.转化 这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关， 原则上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法： 抗生素筛选法 互补法 3.重组子的筛选 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。 １．抗生素筛选法 现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重组子和非重组子。 ２、互补法 菌种 ：E. coli DH5a（空）、 E. coli K12（空） 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器 试剂：LB液体培养基 、 0.1mol/L CaCl2 、 Amp 二、材料、设备及试剂 一、感受态细胞的制备 （一）、受体菌的培养 （二）、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将20ml（每2组）培养液转入离心管中, 于4℃下3000g离心10分钟。 2、弃去上清,用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。 3、弃去上清,加入2ml预冷的0.1m