纳他霉素的发酵工艺.PDF

纳他霉素的发酵工艺 纳他霉素的发酵工艺 纳他霉素的发酵工艺 一、实验的目的 • 了解纳他霉素的发酵生产、提取过程的 基本原理和方法。 • 掌握用高效液相色谱法测定纳他霉素含 量的方法。 二、实验原理 • 本实验以褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus ）SG2002作为抗生素产生 菌，经微生物发酵后合成纳他霉素。纳 他霉素难溶于水，能溶于甲醇中，因此 可用甲醇作为萃取剂提取精制，然后用 高效液相色谱法测定其含量。 三、实验材料 • 1．实验设备与仪器 • 恒温培养箱、摇床、高效液相色谱分析仪、三 角瓶、移液管、7L全自动发酵罐、超净工作台、 TDL低速离心机、普通光学显微镜、电子分析 天平、pH计、YXQG02型电热式蒸汽消毒器、 SBA生物传感分析仪、微量进样器、超声波清 洗器。 • 2．实验材料与试剂 • （1）菌种 • 褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus ） SG2002 • （2）培养基 • 活化培养基（g/L ）：葡萄糖20，蛋白陈5，酵母粉10， 麦芽浸粉10，pH7.0 • 种子培养基（g/L ）：葡萄糖15，蛋白胨5.2，酵母粉 5，NaCl10.7，pH7.5 • 发酵培养基（g/L ）：葡萄糖50，蛋白胨19.5，酵母 粉7，pH7.4－7.5 • 上述培养基湿热灭菌121℃，20min，其中葡萄糖要单 独灭菌115℃，15min。 • （3）试剂与药品 • 葡萄糖、麦芽浸粉、琼脂条、蛋白胨、酵母粉、甲醇、 结晶紫。 四、实验方法与步骤 • 1.褐黄孢链霉菌的发酵罐发酵 • （1）菌种活化 • (2)摇瓶种子 • （3）发酵罐发酵[7L] 2.纳他霉素的提取 • (1)纳他霉素的初提 • 采用甲醇溶媒法，工艺见图。 (2)纳他霉素的精制 • 取一定重量的粗提物溶于一定量的甲醇 中，超声溶解后过滤除去不溶物，采用 活性炭柱法和浸泡法进行脱色，最后浓 缩干燥得精制物 3.纳他霉素产量测定——高 效液相色谱法 • (1)色谱条件 • 检测器：Biotronik BT3030 UV-VIS检测 器； • 色谱柱：Thenomenex Primesphere C18HC 柱（250nm ×4.6mm ）； • 流动相：甲醇：水：磷酸（85：15：0.15， v/v ）； • 流速：1mL/min； • 进样量：20 μL； • 检测波长：303nm； • 柱温：室温。 • (2)测定方法 • ①样品处理 • ②标准溶液的配置 • ③定性 • ④定量 60 y = 1E-05x - 1.4934 2 R = 0.9997 50 40 30 20 浓度（ppm） 10 0 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 响 应 值 纳他霉素HPLC标准曲线 • 4.测量菌体干重 • 将两张滤纸分别在分析天平上称重，然 后放入布氏漏斗。用移液管取5mL发酵 液，用布氏漏斗抽滤，再将滤纸和菌体 在烘箱中50℃干燥至恒重，称量并计算 菌体干重。 五、实验结果 • 1