实验22 含氮化合物的微生物转化.doc

实验22 含氮化合物的微生物转化 在土壤和水体中，有机态氮一般占全氮量的95%以上。经微生物的作用，含氮有机物分解产生氨（氨化作用），氨可被氧化成硝酸盐（硝化作用），硝酸盐又可被还原成氮气（反硝化作用），由此构成氮素循环。其中氨化作用、硝化作用和反硝化作用在氮素转化中意义重大。 一、目的和要求 1.认识氨化细菌，并掌握用奈氏（Nessler）试剂和石蕊试剂测定氨化作用的方法。 2.认识硝化作用和反硝化作用，掌握观察硝化作用和反硝化作用的实验方法。 二、基本原理 蛋白质是复杂的含氮有机物，在生物体中普遍存在。它可以被许多微生物（包括细菌、放线菌和真菌）分解而产生氨，称为氨化作用。在不含无机氮的牛肉膏蛋白胨培养基上，所生长的细菌大多是氨化细菌。氨化细菌分解蛋白质释放氨，可用石蕊试剂和奈氏（Nessler）试剂检测。石蕊试剂遇氨呈蓝色，奈氏（Nessler）试剂与氨反应呈棕褐色。 氨氧化成硝酸的过程，称为硝化作用。它由两类细菌分两个阶段进行。氨氧化成亚硝酸的反应由亚硝化细菌引发，而亚硝酸氧化为硝酸的反应则由硝化细菌所致。亚硝酸与格利斯试剂生成绛红色化合物，硝酸与二苯胺试剂生成蓝色化合物，因此用格利斯试剂和二苯胺，试剂可以监测硝化过程。 在无氧条件下，硝酸盐可以被许多微生物还原成氮气，称为反硝化作用。大多数反硝化菌是异样型微生物，能够以有机物为电子供体，将硝酸或亚硝酸逐步还原成氮气。用格利斯试剂和二苯胺试剂可以监测反硝化过程。 三、实验器材 1.样品：菜园土，阴沟污泥。 2.培养基： （1）牛肉膏蛋白胨培养基1支，装至1.5cm*15cm试管中，每管5ml，经过0.1MPa灭菌20min。 （2）硝化培养基1瓶（见附录），分装至100ml三角瓶，每瓶装30ml，0.1MPa灭菌20min。 （3）反硝化培养基（见附录），分装至1.5cm*15cm试管中，每管10ml，加一杜氏小管，0.1MPa灭菌20min。 3.染色液和试剂：石炭酸复红染液，奈氏（Nessler）试剂，格利斯（Griess）试剂I、II，浓硫酸，二苯胺试剂。 4.仪器及其相关用品：显微镜，香柏油，二甲苯（或1：1的乙醚酒精溶液）， 擦镜纸。 5.其他用品:载玻片，盖玻片，吸水纸，酒精灯，接种环，药匙，白色比色碟，滴管，石蕊试剂（红色）等。 四、实验程序 (一)蛋白质氨化作用 1.接种：放一小匙菜园土（约1g）至装有牛肉膏蛋白胨培养液的试管中。 2.悬挂试纸：在试管口内壁上悬挂1条湿润的红色石蕊试纸，然后塞好棉塞。注意试纸不要伸入培养基内。 3.恒温培养：放入28~30’c的恒温培养箱中培养2-3d。 4.检查结果： (1) 先观察培养管中试纸颜色有无变化，培养液是否混浊或产膜，如红色石蕊试纸变蓝，说明有氨生成，培养液混浊而产膜，说明有大量氨化细菌聚集。 (2)取培养液两滴于比色碟中，加入奈氏试剂一滴，如有棕色或褐色出现，也说明又氨生成。 (3)用接种环曲培养液一环至载玻片上，涂片，固定，染色，在油镜下观察氨化细菌的形态并绘图。 (二) 硝化作用 1.接种：取菜园土1g 左右，接种于盛有铵盐培养液的三角瓶中。 2.恒温培养：放入28~30’c的恒温培养箱中培养7-14d 3.检查结果： (1)取培养液2滴于比色碟中，加格利斯试剂I及II各一滴，如出现绛红色，则证明硝化作用用第一阶段正在进行，即有亚硝酸产生。 (2)另取培养液2滴于比色碟中。先加入2滴浓硫酸，再加入二苯胺试剂1-2滴（注意添加顺序！），观察有无蓝色出现，如有蓝色出现，说明消化作用第二阶段也在进行。即有硝酸存在。以上结果表明消化作用的两个阶段都在进行当中。若只有红色出现，说明只有消化作用的第一阶段存在：若只有蓝色出现，则说明硝化作用已经彻底完成。 (三) 反硝化作用 1.接种：取反硝化作用培养基1管，放入少许阴沟淤泥，塞上盖子。 2.恒温培养：在28-30’c培养一周。 3.检查结果： (1)在培养过程中如有氮气产生，则小管中有气体聚集。 (2)取培养液2滴于比色碟，加格利斯试剂I及II 各1滴，如出现绛红色泽证明有反硝化作用产生的亚硝酸。 五、实验安排 (一)蛋白质氨化作用 自实验开始一天后到实验室观察石蕊试纸有没有变蓝，培养液是否浑浊或产膜，如果2—3天后还没有出现现象，则应重做实验。 (二) 硝化作用 自实验开始后第三或四天起每天到实验室取培养液2滴，滴加格利斯试剂I、II进行检验，需观察是否出现绛红色。再取培养液2滴，先加2滴浓硫酸，再加二苯胺试剂1—2滴，观察是否有蓝色出现。若没现象则后一天继续上述操作观察。预计如果第七天后如果仍没有现象或只出现红色，则该重做。 (三) 反硝化作用 自实验开始每天到实验室观察小管中是否有气体聚集现象（说明有N2产生），再取培养液2滴，滴加格利斯试剂I、II