色谱分析（中国药科大学） 第4章 第16节 高效液相色谱分析.doc

高效液相色谱法 第一节 概述 一、定义与分类 液相色谱是指流动相为液体的这类色谱法的总称。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC），是一种在经典液相色谱基础上发展起来的实用、快速，高效及高灵敏度的分离分析方法。 根据固定相的不同，HPLC可分为以下几类： 液－固吸附色谱法 液－液分配色谱法 化学键合相色谱法 离子交换色谱法 离子对色谱法 凝胶色谱法（又称分子筛色谱法，分子排阻色谱法，尺寸排阻色谱法） 二、HPLC的特点和其它色谱法的比较 （一）与经典液相色谱比较 高分离效能 H=A+B/u+Cu (A=2dp，C与dp2呈线性关系，dp↑→C↑，A↑) 经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。 快速，省时，省材料 经典柱色谱中的柱子多为一次性使用，且体积大（0.1～2m长，0.5～5cm粗），分离速度慢（几小时～几周），每次均要重新装柱，造成人力，物力及时间上的浪费，而一根HPLC柱能重复使用数百次，此外，由于配备了高压输液泵可实现快速分析。 灵敏度高，准确度高，可达1％的分析精度 柱色谱及薄层色谱（TLC）在进行定量分析时影响因素较多，故准确度及重现性均不如高效液相色谱。 HPLC与经典液相色谱的比较 HPLC 经典液相色谱法 色谱柱入口压力/MPa 高压，2 - 20MPa 柱口压力低,0.001～0.1 固定相粒度：粒径/μm 2 - 5 100 色谱柱柱效/（理论塔板数/m） 2000 - 50000 2 - 50 分析速度 分析速度快 分析速度慢 色谱柱使用情况 可重复多次使用 色谱柱只用一次 在线检测情况 能在线检测 不能在线检测 定性定量的准确度 好 差 （二）与GC比较 适合于热不稳定性样品的分析 GC中使用气体为流动相，要求被测样品在气化室高温气化后方可在柱上分离，这就使得热不稳定性样品用GC分析比较困难，需衍生化以保护被测物的不稳定基团 有利于有机酸，碱等极性化合物的分离 这些物质用GC直接来测定时，由于有较大的极性，一方面易产生托尾的现象，另一方面，保留时间过长，因而测定困难，需利用衍生化来减小其极性后方可GC分析 可分离离子型化合物及蛋白质，肽类等大分子化合物 这些物质无法气化，不可GC分析。 总之，HPLC与GC各有所长，互相补充，均成现代分析中不可缺少的工具。 HPLC与GC的比较 GC HPLC 挥发性物质，适用于20％ 的化合物 几乎可以分析各种物质 对热不稳定的物质不能分析 可以用于热不稳定的物质 用毛细管柱色谱可得到很高的柱效 色谱柱不能很长，柱效不会太高 载气不影响分配，靠改变固定相来改变选择性 固定相：没有GC那样种类繁多靠改变流动相来改变选择性 回收困难 可定量回收，可用于制备 第二节 液－固吸附色谱及液－液分配色谱 一 液－固吸附色谱（LSC） 定义 色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normal phase chromatography，NPC）。 液－固吸附色谱是最早出现的，也是最基本的一种柱色谱类型。在吸附色谱中，样品组分（溶质）受到两种力的作用，一是固定相对它的吸附力，二是流动相的“拉力”或溶解力，即溶质处于这两相作用力场的平衡之中。吸附力强而溶解能力差时，溶质有较大的保留；反之，则较先流出色谱柱。溶质，吸附剂和流动相溶剂分子三者间的相互作用，涉及偶极之间的诱导力，静电力，氢键力，色散力，电荷转移或∏络合物形成等相互作用类型。在氧化物型极性吸附型上，静电，诱导，氢键等特殊作用力为主要的作用力，色散力微不足道。但在非极性的固定相，例如多孔碳的情况下，非特殊的色散力是固定相与溶质分子间唯一的相互作用力。 （二）固定相 液—固吸附色谱固定相分类如下： HPLC中液—固吸附色谱固定相用的主要是硅胶。其次是氧化铝。结构类型主要采用薄壳型及全为多孔微粒型两种。 薄壳型及全为多孔微粒型硅胶的示意图 硅胶表面上的活性作用点： 液—固吸附色谱的保留机理：极性。极性小的组分先出峰（正相色谱）。 液—固吸附色谱样品的分离主要是因分子中的极性官能团与固定相表面上活性作用点（如硅醇基）之间的相互作用，这种极性相互作用的强弱归纳如下： 硅胶上各类化合物或官能团吸附强弱的分类