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Here comes your footer 微生物原生质体融合育种 姓名：付凤根 一、概述 原生质体融合(protoplast fusion)是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。 原生质体：细胞内由原生质组成的各种结构统称为原生质体,包括细胞膜、细胞质(包括各种细胞器、细胞骨架系统及胞基质)和细胞核等部分,原生质体是由原生质特化而来。植物细胞即细胞壁内的原生质部分;动物细胞就是原生质体。 原生质体融合：利用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两个亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。 大幅提高亲本间的重组频率 扩大重组的亲本范围 原生质体融合时亲本整套染色体参与交换、遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大。 根据融合的目的选择适宜的直接亲本。现在一般认为亲本应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具有更大的杂种优势。 作为原生质体融合的二亲本都应该有一定的遗传标记，便于重组体的检出。常用的遗传标记有：带隐性性状的营养缺陷、抗性标记、热致死、孢子颜色和菌落形态等作为标记。 实际应用时究竟采用哪各遗传标记，可以根据试验目的确定。 制备原生质体，是原生质体技术的前提和基础，但是不同微生物的细胞壁组成各不相同，所以制备其原生质体的最佳条件也存在着很大差异。 早期人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质， 制备效果都不理想，目前人们主要运用酶法来制备原生质体。人们多倾向于使用复合酶进行处理，常用的酶有纤维素酶、蜗牛酶和几丁质酶等 不同微生物在制备原生质体时所需酶和种类不同， 而且所需酶量也存在着差异。适宜的酶浓度是影响原生质体制备的重要因素， 酶浓度过大时，酶中往往含有对原生质体有害的酶类( 如过氧化物酶、 核糖核酸酶等) ，随着酶量的增加， 杂酶的浓度也会随之增加， 当达到一定浓度时，必然会影响原生质体的活性；酶浓度过大，易使菌体凝集， 难于原生质体化；而且， 细胞脱壁太彻底， 必然降低原生质体的再生率。 菌龄：在菌龄的选择上， 多采用对数生长期或生长中后期的菌， 这是因为， 菌体的不同生理状态直接影响到细胞壁的结构， 对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低， 细胞壁对酶的作用最敏感， 但是对数生长早期的菌相对较为脆弱，受酶的过度作用会影响原生质体的再生率。 酶解时间在原生质体制备过程中也是一个非常重要的因素。 原生质体制备液的p H值， 也可以直接影响到原生质体的制备。因为只有在最适p H值时， 酶的活性才最高， 酶促反应速率才最大 渗透压稳定剂：由于原生质体对渗透压非常敏感， 渗透压稳定剂对于原生质体的制备起着重要作用。常用的渗透压稳定剂有KCl , NaCl , CaCl2 , Mg SO4， 等无机盐和蔗糖、 甘露糖、 山梨醇等， 一般说来， 丝状真菌以无机盐作为稳定剂比较适宜， 而酵母菌则使用糖或醇做稳定剂比较好。 原生质体再形成有生活能力的菌丝称为再生 。不同微生物的原生质体最适再生条件存在一定的差异 培养基：在再生培养基中会添加一些营养物质 这些物质可能是作为细胞壁合成的前体物质 也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢 加速细胞壁合成的作用。 菌龄：菌龄过短的菌丝经酶解破壁形成小原生质体，有的细胞器不完全，营养供给不足再生能力也较低；菌龄长的原生质体再生率高。 Ca2+：Ca2+主要是通过维系膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与活性。 所谓原生质体融合， 就是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁， 使之形成原生质体， 然后在高渗的条件下混合， 并加人物理的或者化学的或者生物的助融条件， 使双亲株的原生质体间发生相互凝集， 通过细胞质融合， 核融合， 而后发生基因组间的交换重组， 进而可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来， 从而获得重组子的过程。 聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。 PEG 分子中常有醚键，使其显示出弱的负电荷，可与水、蛋白质、糖类分子的正电基团形成氢键，而使原生质体连在一起发生凝集，这种作用还可以由于Ca + 的存在而加强。为了发挥PEG 促进细胞融合的效力，必须采用较高的浓度 ( 40 ~5 0%，分子量为6 0 0 0 )，但PEG 在高浓度下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是P E G融合技术的关键。 PEG诱导细胞融合由于具有容易制备和控制、 活性稳定、 使用方便等特点，在细胞融合领域取得了可喜的成绩，大量的研究仍采用此法。虽然PE G 作为融合剂有很多成功的报道，但存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合率较低及经验性大等缺陷。 近年来，一种物理融合技术— 细胞电融合技术