【精选】愈伤组织制作实验.doc

摘 要 水稻成熟种子具有细胞全能性。本实验以+2,4-D为基本培养基，添加NAA和6-BA为分化培养基，对水稻种子材料进行体外培养，诱导形成愈伤组织，并进行分化。在培养基中添加一定量的激素给种子形成愈伤组织提供动力。结果表明，在合适的培养条件下愈伤组织的分化程度很高，但培养基因素或光照条件使得褐化现象严重。 关键词 水稻成熟种子 组织培养 愈伤组织 诱导 分化 激素 1前言 细胞工程是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。其常用技术手段有植物组织培养，植物体细胞杂交、动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等。根据细胞类型的不同，可以把细胞工程分为植物细胞工程和动物细胞工程两大类。本实验主要综述细胞工程中植物细胞工程的植物组织培养这一技术手段。植物组织培养技术的应用范围包括快速繁殖、培育无病毒植物，通过大规模的植物细胞培养来生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等。 植物组织培养，诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织在分化形成植物体。在植物组织培养中，由于植物细胞具有全能性，即植物的体细胞具有母体植株全部遗传信息并会发育成为完整的个体。因而，每一个植物细胞可以像胚胎细胞一样，经离体培养再生成为植株。随着细胞工程技术的不断发展，植物细胞和组织培养这一细胞工程技术也无例外地得到发展，目前已在许多植物上，特别是在农林生产实践中得到了广泛应用。尤其在林木优良品种和无性系的快速繁殖方面进展较快。 本实验旨在利用NAA和6-BA的组合调控来诱导水稻成熟种子的愈伤组织，加深对外植体消毒、接种的无菌操作技术，学习外植体愈伤组织诱导的方法。 6-BA为细胞分裂素，主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。如果超过0.1毫克就会抑制发根，超过0.5毫克则完全不发根。NAA是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根。2,4-D是一种人工合成的植物生长激素。 2实验材料、仪器设备及用具、试剂及培养基 水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 仪器设备及用具 2.2.1仪器设备 超净工作台　培养室 2.2.2用具（每组5人用量） 量筒：100ml×2 培养皿：￠9cm×1 三角瓶：50ml×2(无菌)，1000ml×1 枪形镊：×4 无菌滤纸：（10cm×10cm）×5 试剂及培养基 2.3.1试剂 75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400ml) 2.3.2 培养基 1、诱导培养基：N6+2,4-D2mg/1+蔗糖30g/l+琼脂8g/l 2、分化培养基：N6+ CuSO4·5H2O 1.25mg/l+BA 2mg/l+NAA 1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l 3 实验步骤 3.1接种室、培养基及用具表面消毒 　用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 3.2消毒剂的配制 3.2.1 75%酒精：每组配95ml。量取95%酒精75ml，加蒸馏水至95ml即可. 3.2.2 2%NaCLO：每组配100ml. x：应吸取的NaCLO原液的毫升数； 　　　　　　　　　y：NaCLO原液的有效氯浓度。 3.3种子去壳 　　用自制的脱壳砂纸脱去谷壳，注意保持胚完整。每人准备30粒去壳种子。 3.4外植体消毒（以下工作在超净工作台内进行） 　　将米粒放入50ml无菌三角瓶→无菌水洗一次→弃水，倒入75%酒精，搅拌，30秒→弃酒精，倒入2% NaCLO，不时搅拌，30分钟→弃NaCLO，用无菌水洗3次，每次停留1分钟→倒去无菌水，种子放在带无菌滤纸的培养皿中吸干。 　3.5接种与观察 　　愈伤组织诱导 　　将吸干的种子接入培养基，注意使胚朝上。每瓶接10粒，每人2瓶。写上日期、接种人、放入培养室25℃暗培养。1周后调查计算污染率，2周后调查计算愈伤组织诱导率。 　　　　　　 3.6愈伤组织的再分化观察 无菌条件下将诱导获得的愈伤组织（从约3周后安排此实验），从原材料中用镊子剥离后，接种到分化培养基中，每瓶接种3粒，